孫雪萍 劉振杰 譚小明 柴玲 劉布鳴

[摘要] 目的 篩選廣西特色壯藥田蔥抗氧化活性組分，研究田蔥低極性部位的化學成分。 方法 田蔥乙醇粗提物浸膏分別用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇對粗提物進行萃取得到相應有機相組分。運用酶標儀考察田蔥粗浸膏和各個有機相浸膏對ABTS自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基的清除能力，對石油醚部位成分進行氣相色譜法-質譜法聯(lián)用（GC-MS）分析，運用峰面積歸-化法計算各成分的相對百分含量。 結果 田蔥各萃取相均有一定的抗氧化活性，其中乙酸乙酯相抗氧化活性較好，清除ABTS、DPPH和超氧陰離子自由基的IC50值分別為697.7、742.2 μg/mL和705.8 μg/mL，與陽性對照維生素E的IC50值相當。GC-MS方法從田蔥石油醚相中分析鑒定了41個化合物，有機酸類含量最多（53.59%）。 結論 田蔥低極性部位主要成分為不飽和脂肪酸、萜類和甾體類，所有化合物均為首次從田蔥中發(fā)現(xiàn)。體外抗氧化活性較好的組分主要集中于乙酸乙酯相，為田蔥作為天然抗氧化劑的應用提供研究基礎。

[關鍵詞] 田蔥;抗氧化;氣相色譜法-質譜法聯(lián)用;化學組成

[中圖分類號] R284? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）05（a）-0045-06

Screening of antioxidant active components and the GC-MS analysis of the low polar components from Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner

SUN Xueping1? ?LIU Zhengjie1? ?TAN Xiaoming1? ?CHAI Ling2? ?LIU Buming2

1.College of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning? ?530200， China; 2.Guangxi Key Laboratory of Tradtitonal Chinese Medicine Quality Standards，Guangxi Institute of Traditional Medical and Pharmaceutical Sciences， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning? ?530022， China

[Abstract] Objective To screen out the antioxidant components of Guangxi Zhuang medicine Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner， and to analyze the chemical composition of the low polar components. Methods The ethanol crude extraction of Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner was dispersed in water and extracted by petroleum ether，ethyl acetate and n-butanol to obtain the relative components，respectively. The antioxidant activities of the crude extraction and the organic phase extractions including ABTS，DPPH，superoxide and hydroxyl free radical scavenging ability were investigated by microplate reader. And the gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） was used to analyze the low polar components. The relative percentage of each component was calculated by peak area normalization. Results All the extracted phases of Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner had certain antioxidant activity， among which the ethyl acetate phase had better antioxidant activity， and the IC50 values of ABTS， DPPH and superoxide radical were 697.7， 742.2 μg/mL and 705.8 μg/mL respectively， which were similar to the IC50 values of positive control vitamin E. Forty-one compounds were identified by GC-MS from the petroleum ether phase of the field onion， with the highest organic acid content （53.59%）. Conclusion The main components of the low-polarity parts of Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner are unsaturated fatty acids， terpenes and steroids. All compounds are first discovered from scallions. The components with better antioxidant activity in vitro are mainly concentrated in the ethyl acetate phase， which provides a research basis for the application of Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner as a natural antioxidant.

[Key words] Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner; Antioxidant; Gas chromatography-mass spectrometry; Chemical composition

田蔥科田蔥（Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner）屬于單子葉植物，又名中蔥、剪刀鉸、水鉸剪等。我國主要分布在廣西、廣東、福建、臺灣，生長在濕地、水田、池塘和沼澤地上，是廣西特色壯藥之一[1]。據《中華本草》《中國壯藥資源明錄》[2]記載，其性味微咸（平），具清熱利濕、解毒、治水腫、熱痹、痔瘡腫毒、腳氣等功效。經文獻調研可知關于田蔥的相關報道極少。目前僅Bruce等[3]對田蔥化學成分開展的研究發(fā)現(xiàn)，其含有丁香亭3-0-β-D-吡喃半乳糖甙、山柰酚3-0-二糖甙、異鼠李素3-0-葡萄糖甙、異鼠李素3-0-半乳糖甙、槲皮素3-0-葡萄糖甙、槲皮素3-0半乳糖甙、槲皮素3-0-蕓香糖甙、丁香亭3-0-二糖甙等黃酮苷類成分。未見其他有關于田蔥的物質基礎與藥理活性研究報道。本研究對田蔥石油醚、正丁醇、乙酸乙酯萃取相建立以ABTS自由基、DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力為指標的測定方法，進行田蔥體外抗氧化活性研究，并對其清除能力進行分析，進而篩選出抗氧化活性較好的組分，對石油醚部位成分進行氣相色譜法-質譜法聯(lián)用（GC-MS）分析化學構成，對開發(fā)和綜合利用田蔥有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

田蔥藥材，采自廣西防城港市大坪坡海邊沼澤地，由廣西中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定為田蔥（Philydrum lanuginosum Banks et Sol. ex Gaertner）。樣品標本存放于廣西中醫(yī)藥大學藥學院楊世林科研平臺。

1.2 試劑

ABTS（1 g/瓶，批號：619H033）、DPPH（1 g/瓶，批號：464RB-GE）、維生素E（5 g/瓶，批號：720E033）、鄰苯三酚（60 mmol/L，100 g/瓶，批號：712D022）和Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH=8.2，500 mL/瓶，批號：20181211）均由北京索萊寶科技有限公司生產，其他試劑均為國產分析純。

1.3 儀器

PL203電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;WJX-100高速多功能粉碎機（上海緣沃工貿有限公司）;HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）;Centrifug-e5810R臺式離心機（艾本德中國有限公司）;DLSB-5/20低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長城科工貿有限公司）;SB-800 DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）;RE-2000A旋轉蒸發(fā)儀（鄭州世紀雙科實驗儀器有限公司）;Research plus移液槍（艾本德中國有限公司）;SYNERGY/H1酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.4 樣品的前處理及提取物的制備

準確稱取田蔥藥材10 kg，打粉，過2號篩，加95%乙醇浸泡，超聲波輔助提取3次后進行抽濾，過濾，收集上清液及合并，減壓回收乙醇。上清液經過旋轉蒸發(fā)儀蒸發(fā)，濃縮成浸膏狀的粗提物，然后分別用石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取，回收溶劑后得出石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相4個不同組分的萃取相粗提物。

1.5 樣品液的配置

準確稱取3份0.03 g的4個萃取相的粗提物置于燒杯中，水相用蒸餾水超聲溶解并定容至10 mL的容量瓶，石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相用無水乙醇超聲溶解并定容10 mL的容量瓶，搖勻，得到濃度為3200 μg/mL的母液。然后4個萃取相的母液依次按1600、800、400、200、100 μg/mL的濃度梯度來進行稀釋，溶液備用。陽性對照品維生素E和樣品的濃度一樣，配置同上述樣品母液一樣。

1.6 抗氧化活性的測試

1.6.1 ABTS自由基能力的測定（ABTS法）? 參照文獻[4-5]方法并加以修改。用移液槍吸取不同濃度的樣品液10 μL加入到96孔板中，然后再加入190 μL的ABTS儲備液，混勻，避光反應15 min后于734 nm波長下測其吸光度。水相的空白對照以等量蒸餾水代替樣品液，其他有機相的空白對照以等量無水乙醇代替樣品液。每個樣品平行3次，取平均值。計算公式如下：總抗氧化清除率（%）=（A0-A）/A0×100%。式中：A0為空白值的吸光度，A為樣品的吸光度。

1.6.2 DPPH自由基清除能力的測定? 參照文獻[6]方法并加以修改。用移液槍吸取50 μL不同濃度的樣品液加到96孔板中，再加入50 μL的無水乙醇，最后快速加入0.25 mmol/L的DPPH溶液中，37℃恒溫避光反應30 min后于517 nm波長處測定其吸光度。水相的空白對照以等量蒸餾水代替樣品液，其他有機相的空白對照以等量無水乙醇代替樣品液。每個樣品平行3次，取平均值。計算公式如下：DPPH自由基清除率（%）=（A0-A）/A0×100%。式中：A0為空白值的吸光值，A為樣品的吸光值。

1.6.3 超氧陰離子自由基清除能力的測定（鄰苯三酚自氧化法）? 參照文獻[7]方法并加以調整。用移液槍將1 mL不同濃度的樣液加到96孔板中，再加4.5 mL的Tris-HCI緩沖液（50 mmo/L，pH 8.2），于室溫下反應10 min后加入0.3 mL鄰苯三酚溶液（3 mmol/L），避光反應5 min，最后加入1mL 8 mol/L的鹽酸溶液來終止反應，于299 nm波長處測定其吸光度。水相的空白對照以等量蒸餾水代替樣液，其他有機相的空白對照以等量無水乙醇代替樣液。每個樣品平行3次，取平均值。計算公式如下：超氧陰離子自由基清除率（%）=（A-A0）/A×100%。式中A為樣品的吸光值，A0為空白的吸光值。

1.6.4 羥自由基清除能力的測定（水楊酸法）? 參照文獻[8]方法加以調整。用移液槍準確吸取不同濃度的樣品液50 μL加到96孔板中，然后加入9 mmol/L的FeSO4溶液50 μL、9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液50 μL，混勻，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液50 μL啟動反應體系，于37℃水浴下避光恒溫反應1 h，在510 nm波長處測定其吸光值。水相的空白對照以等量蒸餾水代替樣品液，其他有機相的空白對照以等量無水乙醇代替樣品液。每個樣品平行3次，取平均值。計算公式如下：羥自由基清除率（%）=[1-（A1-A2）/A0]×100%。式中：A0為蒸餾水（或者無水乙醇）代替樣品的吸光度;A1為樣品吸光度;A2為蒸餾水代替H2O2的吸光度。

1.7 數(shù)據處理

本實驗采用Excel表格進行數(shù)據整理和繪圖。以樣品濃度為橫坐標，清除率為縱坐標作圖，使用回歸分析方法求出清除率為50%時樣品的濃度（IC50），使用IC50來表示樣品的抗氧化活性結果。

1.8 甲醋化處理方法

取田蔥石油醚相1 g，置于50 mL具塞燒瓶中，加石油醚（60～90℃）-苯（1∶1） 20 mL使其溶解，加0.4 mol/L KOH-甲醇溶液10 mL，搖勻，置于40℃恒溫水浴1 h;加純凈水20 mL，振搖，靜置待分層清晰后取上清液，經無水硫酸鈉脫水，濾過，濾液作為供試品溶液[9]。

1.9 GC-MS分析條件

色譜條件：Agilent HP-5Ms毛細管色譜柱（30 nm×0.25 nm×0.25 μm）;初始溫度120℃，保持3 min，以1.5 ℃/min升溫至300℃，保持20 min;載氣：He;流速：1 mL/min;進樣量：0.2 μL;分流比：20∶1;離子源溫度：230℃;四級桿溫度：150℃;離子源：EI，電離能量：70 eV;進樣口溫度：230℃;離子源溫度：230℃;掃描質量范圍：35～450 amu。

2 結果

2.1 ABTS自由基清除能力的變化

田蔥不同濃度的各萃取相對ABTS自由基清除率呈現(xiàn)出良好的量-效關系。使用回歸分析方法得到回歸方程，計算得到乙酸乙酯相的IC50值為697.7 μg/mL，與陽性對照維生素E的IC50（549.6 μg/mL）相當，正丁醇相、水相、石油醚相的IC50值較大（分別為1043.9、3209.3、7584.0 μg/mL），清除活性均較弱。見圖1。

2.2 DPPH自由基清除能力的變化

田蔥不同濃度的萃取相測定DPPH自由基清除率為4%～90%。使用回歸分析方法得到回歸方程，計算得到正丁醇相和乙酸乙酯相的IC50值分別為761.8、742.2 μg/mL，與陽性對照維生素E的IC50（539.2 μg/mL）相當，而水相、石油醚相的IC50值較大（分別為1 004 527.4、6872.2 μg/mL），清除活性均較弱。由此，各萃取相對DPPH自由基的清除能力從大至小依次為：乙酸乙酯相、正丁醇相、石油醚相、水相。見圖2。

2.3 超氧陰離子自由基清除能力的變化

水相與其他幾個相對超氧陰離子自由基比較，清除率最弱。使用回歸分析方法得到回歸方程并計算得到正丁醇相和乙酸乙酯相的IC50值分別為790.8、705.8 μg/mL，乙酸乙酯相的IC50值比陽性對照維生素E的IC50（779.3 μg/mL）低，而水相和石油醚相IC50值較大（分別為4652.9、1054.4 μg/mL），清除活性均較弱。因此各相對超氧自由基的清除能力由大到小依次為：乙酸乙酯相、正丁醇相、石油醚相、水相。見圖3。

2.4 羥自由基清除能力的變化

田蔥不同濃度的萃取相對羥自由基清除能力大小依次為：石油醚相、水相、正丁醇相、乙酸乙酯相，且呈量-效關系。使用回歸分析方法得到回歸方程，計算得到石油醚相的IC50值為4933.5 μg/mL，比陽性對照維生素E的IC50（3238.4 μg/mL）稍高，水相、正丁醇相和乙酸乙酯相的IC50值較大（分別為1 081 283.9、167 981.6、77 814 578.3 μg/mL），清除活性均較弱。見圖4。

圖4? ?田蔥各萃取相對羥自由基的清除活性

2.5 田蔥石油醚部位脂溶性成分的GC-MS分析總離子流圖

對甲酯化處理以后的田蔥石油醚相脂溶性成分進行GC-MS分析，各峰的保留時間和豐度值見圖5。所得的質譜圖通過Mass Hunter質譜工作站、NIST11標準質譜數(shù)據庫檢索，并按峰面積歸一化法計算揮發(fā)油中各化合物的百分含量見表5。

3 討論

體內高活性分子自由基產生過多，大量自由基積累導致氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡[10]?？寡趸瘎┖涂寡趸δ苁称纺軌蛴行б种谱杂苫难趸磻?，從而有效預防各種與自由基相關疾病的發(fā)生[11-15]。研究顯示[16-18]，傳統(tǒng)合成抗氧化劑本身可能具有潛在毒性，在食品添加中要嚴格控制比例，以防對人體造成危害，所以開發(fā)安全性高、抗氧化能力強的天然抗氧化劑日益受到關注。從傳統(tǒng)中藥和民族藥中尋找天然抗氧化劑，并對抗氧化活性成分及抗氧化機制進行闡釋已成為近年來食品藥品研究領域的熱點和焦點[19-20]。本研究為系統(tǒng)研究壯藥田蔥體外抗氧化活性，篩選出抗氧化活性較好的組分，選取總抗氧化清除能力、DPPH自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力、羥自由基清除能力為篩選指標。研究結果顯示，田蔥4個萃取相均有一定清除自由基的能力，是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑。乙酸乙酯相對ABTS自由基清除率IC50值為697.7 μg/mL，對DPPH自由基的IC50值為742.2 μg/mL，對超氧自由基的IC50值為705.8 μg/mL，可見田蔥體外抗氧化活性較好的組分主要集中于乙酸乙酯相。

本研究以壯藥田蔥為研究對象，所采用4種方法均為中藥在體外抗氧化活性篩選中常見的方法，簡便、快速、準確。但是這些方法都是在非生理條件下進行的，這些結果不能外推為體內的結果[21-22]。因此，研究下一步將是采用細胞學實驗和體內外實驗相結合的方法綜合評價田蔥的抗氧化活性。

運用GC-MS方法，自田蔥石油醚相中鑒定出的化合物百分含量占總峰面積的92.57%以上。分析結果可見石油醚相中有機酸類含量最多（53.59%），其中含量最高的為棕櫚酸（23.57%），其次為亞麻酸（13.47%）、亞油酸（9.08%）和硬脂酸（2.99%）。甾體類化合物41含量也非常高（16.845%），其他成分主要為倍半萜類或者烯萜類化合物，τ-muurolol（2.368%）。

國內鮮見對中國傳統(tǒng)壯藥田蔥活性物質和抗氧化活性的相關報道，所鑒定成分也均未在田蔥中被報道過，研究結果豐富了田蔥的化學成分，為該廣西特色壯藥的開發(fā)利用提供基礎。許多疾病與自由基所引發(fā)的氧化作用有關，如風濕、糖尿病、衰老等癥狀[19-20]。本研究證實了田蔥具有一定的自由基清除活性，提示壯藥田蔥可作為一種良好的天然抗氧化劑，篩選出乙酸乙酯相的抗氧化活性較好，為從壯藥田蔥開發(fā)新的天然抗氧化劑提供參考數(shù)據和方法。

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（收稿日期：2019-11-18? 本文編輯：劉永巧）