李北林 鄧益斌 羅艷紅

[摘要] 目的 觀察松花粉對(duì)人肝癌SK-Hep-1細(xì)胞凋亡和自噬的影響，探討松花粉抗腫瘤作用及機(jī)制，為松花粉的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法 體外培養(yǎng)SK-Hep-1細(xì)胞，隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組、松花粉小劑量組（30 mg/mL）、松花粉中劑量組（45 mg/mL）、松花粉大劑量組（60 mg/mL）。CCK-8法檢測(cè)不同濃度松花粉干預(yù)不同時(shí)間（12、24、48、72 h）后的SK-Hep-1細(xì)胞抑制率;松花粉處理48 h后，相差顯微鏡和Hoechst33258熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué);流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡率;RT-PCR檢測(cè)自噬相關(guān)mRNA表達(dá)水平。 結(jié)果 CCK-8法檢測(cè)顯示，松花粉能顯著抑制SK-Hep-1細(xì)胞增殖，并具有時(shí)間和劑量依賴性;相差顯微鏡顯示松花粉可以抑制細(xì)胞的增殖;Hoechst33258熒光染色顯示，與對(duì)照組比較，松花粉小、中、大劑量組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的凋亡樣改變;Annexin V-FITC/PI雙染法結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，松花粉小、中、大劑量組細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）;RT-PCR分析顯示，與對(duì)照組比較，松花粉干預(yù)48 h后，松花粉小、中、大劑量組Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)明顯上調(diào)，而P62表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。 結(jié)論 松花粉能有效抑制人肝癌SK-Hep-1細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，并誘導(dǎo)其發(fā)生自噬，松花粉可能通過(guò)誘導(dǎo)自噬促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 松花粉;SK-Hep-1細(xì)胞;凋亡;自噬

[中圖分類號(hào)] R285? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）05（a）-0013-05

Study on the effect of apoptosis and autophagy of pine pollen on human hepatocellular carcinoma SK-Hep-1 cells

LI Beilin? ?DENG Yibin? ?LUO Yanhong

Youjiang Medical University for Nationalities， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Baise? ?533000， China

[Abstract] Objective To observe the effect of pine pollen on apoptosis and autophagy of human hepatocellular carcinoma SK-Hep-1 cells， and to explore the anti-tumor effect and mechanism of pine pollen， so as to provide experimental basis for the clinical application of pine pollen. Methods SK-Hep-1 cells were cultured in vitro and randomly divided into 4 groups： the control group， the pine pollen low-dose group （30 mg/mL）， the pine pollen medium-dose group （45 mg/mL）， and the pine pollen high-dose group （60 mg/mL）. The inhibition rate of SK-Hep-1 cells was determined by CCK-8 method after pine pollen intervention at different concentrations at different time （12， 24， 48 and 72 h）. After pollen treatment for 48 h， cell morphology was observed by phase contrast microscopy and Hoechst33258 fluorescence staining. The apoptosis rate was observed by flow cytometry and mRNA expression levels of autophagy were detected by RT-PCR. Results CCK-8 assay showed that pine pollen could significantly inhibit SK-Hep-1 cell proliferation in time and dose dependence. Phase contrast microscopy showed that pine pollen could inhibit cell proliferation. Hoechst33258 fluorescence staining showed that， compared with the control group， the pine pollen low-dose， medium-dose and high-dose groups showed obvious apoptotic changes in cell morphology. Annexin V-FITC/PI double staining results showed that the apoptosis rates in the pine pollen low-dose， medium-dose and high-dose groups were significantly increased compared with the control group， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. RT-PCR analysis showed that， compared with the control group， intervention of pine pollen intervention after 48 h， the expression of Beclin-1， LC3-Ⅱwas up-regulated obviously in the pine pollen low-dose， medium-dose and high-dose groups， but P62 expression was down-regulated， with statistically significant differences （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Pine pollen can effectively inhibit the proliferation of human hepatocellular carcinoma SK-Hep-1 cells， promote their apoptosis， and induce their autophagy. Pine pollen may promote apoptosis of hepatocellular carcinoma cells by inducing autophagy.

[Key words] Pine pollen; SK-Hep-1 cells; Apoptosis; Autophagy

肝癌是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，肝癌死亡率占全世界癌癥死亡的第3位，其中占男性癌癥死亡率的第2位[1]。中國(guó)是全球肝癌發(fā)病率最高的國(guó)家之一，其死亡人數(shù)占世界肝癌死亡人數(shù)的50%[2]。肝癌發(fā)病率與年齡和性別有關(guān)，隨年齡增長(zhǎng)而升高，男性發(fā)病率為女性的3倍[3]。肝癌具有惡性程度高、易復(fù)發(fā)、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)[4]，因此，肝癌的防治已成為醫(yī)藥界亟待解決的問(wèn)題。

松花粉（pine pollen），為松科植物馬尾松和油松等的花粉。其味甘、性溫，具有止血、祛風(fēng)益氣、收濕等功效[5]。通過(guò)H22荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)，證明松花粉主要通過(guò)逆轉(zhuǎn)荷瘤小鼠的膽汁酸合成降低以及其他的氨基酸代謝障礙發(fā)揮體內(nèi)的抗腫瘤作用[6]。因此，本研究從體外實(shí)驗(yàn)探討松花粉作用于SK-Hep-1細(xì)胞后，其增殖、凋亡和自噬的變化，為松花粉的臨床應(yīng)用提供更多的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株SK-Hep-1細(xì)胞，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)。

1.2 藥物及試劑

松花粉（中國(guó)新時(shí)代公司，批號(hào)：1907012）;DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibico公司，批號(hào)：C11995500BT）;胎牛血清（浙江天抗生物公司，批號(hào)：11011-8611）;Hoechst33258熒光染料（索萊寶公司，貨號(hào)：IH0060）;CCK-8檢測(cè)試劑盒（博士德生物公司，貨號(hào)：AR1160）;Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（賽默飛公司，貨號(hào)：88-8005-72）;熒光定量試劑盒（Roche公司，貨號(hào)：4913914001）;AxyPrep總RNA小量制備試劑盒（AxyPrep公司，貨號(hào)：AP-MN-MS-RNA-50G）。

1.3 儀器

CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本三洋公司，型號(hào)：MCO-18AIC），高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，型號(hào)：5427R）;倒置相差顯微鏡（Leccia公司，型號(hào)：LEICADMIL）;羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（德國(guó)Roche，型號(hào)：lightCycler96）;多功能酶標(biāo)儀（Berthold，型號(hào)：TriStar LB941）;流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司，型號(hào)：FACSVerse）;生物安全柜（蘇凈集團(tuán)安泰公司，型號(hào)：BSC-1600ⅡB2）。

1.4 藥物制備

9 g松花粉溶于300 mL雙蒸水中，小火煮開(kāi)15 min，濃縮至100 mL，過(guò)濾取上清液，藥物濃度為90 mg/mL。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

SK-Hep-1細(xì)胞置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM及含1%青霉素與鏈霉素雙抗。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞為研究樣本，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)分為4組：對(duì)照組、松花粉小劑量組（30 mg/mL）、松花粉中劑量組（45 mg/mL）、松花粉大劑量組（60 mg/mL）。

1.6 CCK-8法檢測(cè)松花粉對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞增殖能力的作用

SK-Hep-1細(xì)胞接種于96孔板中，每孔5×104個(gè)細(xì)胞。分別設(shè)置空白對(duì)照組、正常對(duì)照組，以不同濃度松花粉處理細(xì)胞12、24、48和72 h，每個(gè)組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。按試劑說(shuō)明書(shū)操作。抑制率=[（對(duì)照孔OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值）/（對(duì)照孔OD值-空白孔OD值）]×100%吸光度。

1.7 相差顯微鏡觀察SK-Hep-1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

以“1.5”分組方法處理細(xì)胞，藥物干預(yù)48 h后，相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。

1.8 Hoechst33258檢測(cè)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

細(xì)胞接種于12孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。藥物作用48 h后吸出培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗2次。用4%的甲醛室溫固定15 min，取出PBS清洗3次。Hoechst33258試劑常溫避光染色30 min后，PBS清洗3次。直接在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.9 Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)松花粉對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞凋亡的影響

以“1.5”分組方法處理細(xì)胞，藥物干預(yù)48 h后，消化并收集細(xì)胞，1000 r/min，半徑5 cm，離心3 min。用1×Binding Buffer緩沖液將各組的細(xì)胞密度調(diào)至5×106/mL，培養(yǎng)48 h，按試劑說(shuō)明書(shū)操作。

1.10 RT-PCR檢測(cè)自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3-Ⅱ、P62的mRNA表達(dá)水平

以“1.5”分組方法處理細(xì)胞，藥物干預(yù)48 h后，去除培養(yǎng)基。①細(xì)胞總RNA的提?。翰捎肁xyPrep總RNA小量制備法提取總RNA，再使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA的1 μg mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件：42℃ 60 min，70℃10 min。②qPCR：PCR反應(yīng)體系為50 μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃15 s，58℃ 10 s和72℃ 10 s，完成45個(gè)循環(huán)。qPCR使用羅氏LightCycler96實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)。以GAPDH作為內(nèi)參，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt表示mRNA的相對(duì)定量，ΔCt=Ct靶基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。引物詳細(xì)序列見(jiàn)表1。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 松花粉對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞增殖的影響

使用不同濃度的松花粉處理SK-Hep-1細(xì)胞后，細(xì)胞受到明顯的抑制。隨著松花粉濃度和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率逐漸增高。各濃度及作用時(shí)間對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞的影響見(jiàn)圖1。由于松花粉作用48 h時(shí)，抑制率基本達(dá)到平臺(tái)期，故后續(xù)的實(shí)驗(yàn)均采用48 h。

2.2 松花粉抑制SK-Hep-1細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

與對(duì)照組比較，松花粉小、中、大劑量組細(xì)胞數(shù)目逐漸減少，細(xì)胞間隙增大，排列紊亂，細(xì)胞形態(tài)固縮變圓，隨著松花粉濃度的增大，部分細(xì)胞基本失去原有的形態(tài)，呈漂浮狀。見(jiàn)圖2。

2.3 Hoechst33258染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

對(duì)照組SK-Hep-1細(xì)胞胞膜完整，輪廓分明，核呈圓形，著色比較均勻。隨著松花粉濃度的增大，可見(jiàn)細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡的特征性改變：核固縮，核碎裂，形成大小不一的塊狀。細(xì)胞核的改變見(jiàn)圖3。

2.4 松花粉對(duì)SK-Hep-1細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組比較，不同濃度的松花粉干預(yù)SK-Hep-1細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率隨著松花粉濃度的增大而增大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)圖4、表2。

2.5 松花粉誘導(dǎo)肝癌SK-Hep-1細(xì)胞自噬相關(guān)mRNA表達(dá)水平的改變

與對(duì)照組比較，松花粉干預(yù)48 h后，松花粉小、中、大劑量組Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)明顯上調(diào)，而P62表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見(jiàn)圖5。

3 討論

肝癌的治療方法主要有放化療、生物免疫治療、分子靶向藥物治療和手術(shù)切除等，此類治療措施對(duì)中晚期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病灶治療效果不佳，其主要用于治療早期小肝癌等[7-8]。同時(shí)，放化療藥物毒副作用大，價(jià)格昂貴，對(duì)患者造成極大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥通過(guò)抑制肝癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制侵襲和遷移等作用，達(dá)到殺滅肝癌細(xì)胞的目的[9]。中草藥相比于西藥，毒副作用小，通過(guò)中草藥可以達(dá)到延緩衰老、抗疲勞、保健等目的[10]。

松花粉，富含多糖、維生素、礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分和近百種生物活性成分[11]。近年研究發(fā)現(xiàn)松花粉具有增強(qiáng)免疫力、改善胃腸道功能、保護(hù)肝臟、調(diào)節(jié)血脂和抑制前列腺增生等作用[12]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)，松花粉在大鼠模型中不會(huì)引起明顯的毒性[13]。同時(shí)，松花粉具有明顯的增效減毒作用[14-15]。

本課題組前期以松花粉處理人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株，闡明了松花粉具有對(duì)抗肝癌細(xì)胞的持續(xù)生長(zhǎng)、抑制血管生成和細(xì)胞遷移的作用。本研究通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)和相差顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)松花粉對(duì)細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的自主有序的死亡，是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象。促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)腫瘤治療有著重要的意義[16-17]。本研究結(jié)果提示，松花粉可以促進(jìn)SK-Hep-1細(xì)胞凋亡，其凋亡率與松花粉呈明顯的量效關(guān)系。熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核出現(xiàn)凋亡的特征性改變：核固縮，核碎裂。

細(xì)胞自噬是真核生物中進(jìn)化保守的對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行周轉(zhuǎn)的重要過(guò)程[18]。自噬過(guò)程中一些損壞的蛋白或細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小泡包裹后，送入溶酶體或囊泡中進(jìn)行降解并得以循環(huán)利用[19]。泛素結(jié)合蛋白P62與蛋白質(zhì)的泛素化密切相關(guān)，P62是反映自噬活性的標(biāo)記蛋白之一，其含量間接反映自噬小體清除水平[20]。LC3-Ⅱ和Beclin-1在哺乳動(dòng)物細(xì)胞自噬過(guò)程中起著促進(jìn)作用[21]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)自噬相關(guān)mRNA表達(dá)水平的研究，松花粉作用48 h后，與對(duì)照組比較，自噬相關(guān)基因Beclin-1、LC3-Ⅱ表達(dá)明顯上調(diào)，而P62表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。這表明，SK-Hep-1細(xì)胞經(jīng)松花粉處理后發(fā)生了自噬。

綜上所述，松花粉對(duì)肝癌SK-Hep-1細(xì)胞具有明顯的抑制增殖并誘導(dǎo)凋亡和自噬的作用，它可能通過(guò)誘導(dǎo)自噬促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。松花粉有望成為治療肝癌的新藥物，為臨床上肝癌的治療方案提供新的思路和途徑。

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（收稿日期：2019-08-20? 本文編輯：顧家毓）