梁財(cái) 陳穎 李昌恒 宋祥民 謝昌平 朱朝華 孫然鋒

摘 要：? 該文采用菌絲生長(zhǎng)速率法，研究了山芝麻根、莖和葉不同溶劑萃取物在1.5 mg·mL-1濃度下對(duì)10種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性，用孢子萌發(fā)法測(cè)試了山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用，用離體法測(cè)試了山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病的防治效果，并通過(guò)氣相與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）分析了山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物的主要成分，測(cè)試了其中8種主要化合物對(duì)香蕉炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制活性。結(jié)果表明：山芝麻各部分萃取相對(duì)10種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)均具有不同程度的抑制作用。其中：在1.5 mg·mL-1濃度下，山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率分別為87.00%和86.14%，其EC50分別為0.062 mg·mL-1和0.052 mg·mL-1;濃度在2、4、8 mg·mL-1時(shí)，山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率均在70%以上;在10 mg·mL-1濃度下，山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病的防治效果分別為72.32%和59.77%。通過(guò)氣相與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物進(jìn)行了分析，在山芝麻根石油醚相萃取物中共鑒定出36種主要化學(xué)成分，在山芝麻根乙酸乙酯相萃取物中共鑒定出17種主要化學(xué)成分。對(duì)選取的8種主要化合物，在100 μg·mL-1濃度下，鄰苯二甲酸二異丁酯和鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)香蕉炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)顯現(xiàn)出較高的抑制活性，抑制率分別為65.12%和68.07%，EC50分別為56.66 μg·mL-1和37.04 μg·mL-1。

關(guān)鍵詞： 山芝麻， 植物病原真菌， 抑菌活性， 氣相與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)， 鄰苯二甲酸二異丁酯， 鄰苯二甲酸二丁酯

中圖分類號(hào)：? Q939

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：? A

文章編號(hào)：? 1000-3142（2020）05-0715-12

Antifungal activity of extracts of Helicteres ngustifolia against ten plant pathogenic fungi

LIANG Cai1，2， CHEN Ying1，2， LI Changheng1，2， SONG Xiangmin1，2， XIE Changping1，2， ZHU Chaohua1，2， SUN Ranfeng1，2*

（ 1.? Key Laboratory of Green Prevention and Control of Tropical Plant Diseases and Pests （Hainan University）， Ministry of Education， Haikou 570228， China; 2. College of Plant Protection， Hainan University， Haikou 570228， China ）

Abstract：? The mycelial growth inhibition activities of different solvent extracts of root， stem and leaf? of Helicteres angustifolia against 10 plant pathogenic fungi were studied by the mycelium growth rate method at 1.5 mg·mL-1. The inhibitory effects of root petroleum ether and root ethyl acetate extracts of Helicteres angustifolia on the spore germination in Colletotrichum musa were determined by spore germination method. The control effects of the root petroleum ether and root ethyl acetate extracts of Helicteres angustifolia against Colletotrichum musae were determined by in vitro method. The main components of root petroleum ether and ethyl acetate extracts of Helicteres angustifolia were analyzed by gas chromatography-mass spectrometer （GC-MS）， and the mycelial growth inhibition activities of eight main compounds against Colletotrichum musa were tested. The results were as follows： Extracts each plant of Helicteres angustifolia showed different degrees of mycelial growth inhibitory effects on 10 plant pathogenic fungi. The mycelial growth inhibition rates of the root petroleum ether and ethyl acetate extracts of Helicteres angustifolia against Colletotrichum musae reached 87.00% and 86.14% at 1.5 mg·mL-1， and the EC50 values were 0.062 and 0.052 mg·mL-1， respectively. The relative inhibitory rates of the root petroleum ether and root ethyl acetate extracts of Helicteres angustifolia on the spore germination against Colletotrichum musae were more than 70% at 2， 4 and 8 mg·mL-1. At 10 mg·mL-1 ， the control effects of the root petroleum ether and root ethyl acetate extracts of Helicteres angustifolia against Colletotrichum musae were 72.32% and 59.77%， respectively. The root petroleum ether and root ethyl acetate extracts of Helicteres angustifolia were analyzed by GC-MS. In total， 36 major chemical components were identified in the root petroleum ether extracts， 17 major chemical components were identified in the root ethyl acetate extracts. Among the selected eight major compounds， diisobutyl phthalate and dibutyl phthalate showed higher mycelial growth inhibitory effects against Colletotrichum musae. The inhibition rates was 65.12% and 68.07% at 100 μg·mL-1， respectively. The EC50 values were 56.66 μg·mL-1 and 37.04 μg·mL-1， respectively.

Key words：? Helicteres angustifolia， plant pathogenic fungi， antifungal activity， GC-MS， diisobutyl phthalate， dibutyl phthalate

山芝麻（Helicteres angustifolia）為梧桐科（Sterculiaceae）山芝麻屬（Helicteres）矮灌木植物，廣泛分布于澳大利亞、日本、老撾、中國(guó)等東南亞國(guó)家。目前，對(duì)于山芝麻的化學(xué)成分研究主要集中在醌類、倍半萜類（Guo et al.，2005）、酯類（魏映柔等，2011）、三萜類（Chen et al.，1990）、酚類、黃酮類（Li et al.， 2015）、香豆素類（Chang et al.，2001）、葫蘆素類（Chen et al.，2006）、多糖類（Liu et al.，2018）、類固醇（Chen et al.， 2006）、木脂素類（Chin et al.，2006）和生物堿類（Pan et al.，2008; Wang et al.，2012）等化合物。 一些關(guān)于山芝麻的生物學(xué)研究證明，該植物提取物具有抗菌、抗糖尿病、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)功能、抗腫瘤等活性（Lin et al.，2012;Hu et al.，2016;Li et al.，2016）。山芝麻水提物能平衡潰瘍性結(jié)腸炎大鼠血清中炎癥因子水平，并改善其病理組織損傷和癥狀（高玉橋等，2012）;Huang et al.（2013）在山芝麻中分離出山芝麻甲酯，能夠顯著緩解由乙型肝炎病毒造成的大鼠肝損傷;Sun et al.（2018，2019）在山芝麻中提取的一些多糖類物質(zhì)可以抑制小鼠體內(nèi)腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，并進(jìn)一步對(duì)這些多糖體分離純化，發(fā)現(xiàn)了酸性雜多糖類化合物SPF3-1，此化合物可以顯著提高巨噬細(xì)胞的增殖力，刺激巨噬細(xì)胞的吞噬能力，誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子生成，具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)活性;Yang et al.（2019）對(duì)山芝麻的愈傷組織進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，并對(duì)培養(yǎng)的愈傷組織進(jìn)行提取，研究發(fā)現(xiàn)山芝麻的愈傷組織懸浮液乙醇提取物中含有豐富的酚類、黃酮類、萜類、皂苷類、三萜類化合物，并且具有很強(qiáng)的抗氧化活性以及抑制大鼠體內(nèi)蔗糖酶和麥芽糖酶活性，還能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞增殖能力和吞噬活性。目前，對(duì)于山芝麻的研究主要集中在醫(yī)藥領(lǐng)域，用于治療各種人類疾病，但在農(nóng)用抑菌活性方面的研究報(bào)道還比較少。

本課題組開(kāi)展了海南植物的抑菌活性篩選，發(fā)現(xiàn)山芝麻提取物對(duì)植物病原真菌具有一定的抑菌活性。為進(jìn)一步研究山芝麻的抑菌活性，先用95%乙醇對(duì)山芝麻根、莖、葉三部分進(jìn)行浸泡提取，再利用不同有機(jī)溶劑制備山芝麻不同相萃取物，研究各相萃取物對(duì)10種植物病原真菌的抑菌活性，然后用離體果實(shí)法測(cè)試了山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病的防治效果，最后通過(guò)氣相與質(zhì)譜連用技術(shù)（Gas Chromatography-Mass Spectrometer，GC-MS）對(duì)山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物進(jìn)行了初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 山芝麻 山芝麻采自廣東省云浮市郁南縣宋桂鎮(zhèn)，選取生長(zhǎng)狀況良好的植株，整株采回。

1.1.2 供試植物病原菌菌株 供試植物病原菌菌株為火龍果潰瘍病菌（Neoscytalidium dimidiatum）、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria dothidea）、香蕉炭疽病菌（Colletotrichum musae）、玉蜀黍赤霉病菌（Gibberella zeae）、山茶灰斑病菌（Pestalotipsis guepinii）、水稻惡苗病菌（Fusarium moniliforme）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、番茄早疫病菌（Alternaria solani）和芒果蒂腐病菌（Botryodiplodia theobromae），這些菌株均來(lái)源于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China）和海南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，菌種保存于4 ℃冰箱，活化后備用。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，用于植物病原真菌的培養(yǎng)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、棕櫚酸乙酯、2，6-二甲氧基苯酚、亞油酸、亞油酸甲酯、亞油酸乙酯、丁香醛均購(gòu)買于阿拉丁;95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、DMF（N， N-二甲基甲酰胺）、吐溫-80等采購(gòu)于西隴科學(xué)股份有限公司;0.22 μm針頭過(guò)濾器由上海楚定分析儀器有限公司生產(chǎn)，Agilent Technologies 7000型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀由安捷倫科技（中國(guó)）有限公司生產(chǎn)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV 8）由德國(guó)IKA（中國(guó)）有限公司生產(chǎn)，超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1D）由蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 山芝麻粗提物的制備 將剛采集的新鮮山芝麻整理成根、莖、葉三部分，用蒸餾水沖洗干凈，自然晾干，然后放于烘箱50 ℃烘干，切成3 cm長(zhǎng)的小段，用粉碎機(jī)粉碎均勻。稱取山芝麻根、莖、葉粉末各1.5 kg，置于15 L 95%乙醇中浸泡24、48、72 h，分別提取有機(jī)相，合并有機(jī)相并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮至膏狀，得到的浸膏加適量的水稀釋，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，三種溶劑萃取過(guò)后余下的液體即為水相，最后將各相濃縮至膏狀，真空干燥，分別得到山芝麻石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物和水相萃取物，置于冰箱4 ℃保存，備用。

1.2.2 氣相與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析條件 氣相條件：HP-5MSC彈性石英毛細(xì)管柱（30 m × 250 μm × 0.25 μm）;色譜柱初始溫度60 ℃保持1 min，以6 ℃·min-1升溫至300 ℃保持17 min;進(jìn)樣口溫度為250 ℃，載氣為氦氣，載氣流量為1.0 mL·min-1;采用不分流模式。

質(zhì)譜條件：采用電子轟擊離子源（electron impact ion source），電子能量為70 eV，離子源溫度為250 ℃，MS四極桿溫度為150 ℃，傳輸線溫度為280 ℃，質(zhì)量掃描范圍（m/z）為20～450。

1.2.3 山芝麻各相萃取物對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)抑制活性測(cè)試 采用菌絲生長(zhǎng)速率法（吳文君，1987）對(duì)10種植物病原真菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定。 稱取75 mg山芝麻各相萃取物溶解于0.1 mL N，N-二甲基甲酰胺中，用0.22 μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾，然后在超凈工作臺(tái)中，與49.9 mL融化PDA培養(yǎng)基混合，配置成山芝麻萃取物濃度為1.5 mg·mL-1的培養(yǎng)基，倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中冷卻凝固。在培養(yǎng)5 d的菌種上，用直徑為6 mm打孔器打取生長(zhǎng)整齊一致菌餅，將菌餅移植到培養(yǎng)基中心（1皿1個(gè)菌餅），使菌絲面向下接觸培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)，加入等體積的N，N-二甲基甲酰胺為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次，倒置培養(yǎng)。待菌落直徑達(dá)到5 cm及以上后，用十字交叉法測(cè)量并記錄菌落直徑，按下述公式計(jì)算抑制率。

菌落直徑 （cm） =測(cè)量直徑-菌餅直徑;

菌絲生長(zhǎng)抑制率=[（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑） /對(duì)照菌落直徑]×100%。

1.2.4 8種化合物對(duì)植物病原菌菌絲生長(zhǎng)抑制活性測(cè)試 分別稱取1.1.2的8種化合物各5 mg溶于0.1 mL N，N-二甲基甲酰胺中，用0.22 μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾，然后在超凈工作臺(tái)中，與49.9 mL融化PDA培養(yǎng)基混合，配置成化合物濃度為100 μg·mL-1培養(yǎng)基，其余操作方法同1.2.3。

1.2.5 山芝麻各相萃取物對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的EC50測(cè)定 選取對(duì)供試植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)抑制活性在70%以上的萃取物進(jìn)行EC50測(cè)定。將待測(cè)萃取物用一定量N，N-二甲基甲酰胺溶解，用0.5%吐溫-80水溶液稀釋成1 000、500、250、125、62.5 mg·mL-1一系列濃度梯度的母液，用0.22 μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾。然后在超凈工作臺(tái)中，將0.1 mL母液分別與49.9 mL融化PDA培養(yǎng)基混合，配置成山芝麻萃取物濃度分別為2、1、0.5、0.25、0.125 mg·mL-1的培養(yǎng)基，其余操作方法同1.2.3。

1.2.6 8種化合物對(duì)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的EC50測(cè)定 將待測(cè)化合物用一定量N，N-二甲基甲酰胺溶解，用0.5%吐溫-80水溶液稀釋成7.5、5、2.5、1.25和0.625 mg·mL-1一系列濃度梯度的母液，并用0.22 μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾。然后在超凈工作臺(tái)中，將0.1 mL母液分別與49.9 mL融化PDA培養(yǎng)基混合，配置成濃度分別為150、100、50、25、12.5 μg·mL-1的培養(yǎng)基，其余操作步驟同1.2.3。

1.2.7 山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率測(cè)定 參考瓊脂平板表面萌發(fā)法（方中達(dá)，2007）。取培養(yǎng)5 d的香蕉炭疽病菌，加入10 mL無(wú)菌水到培養(yǎng)皿中，用涂布棒將分生孢子和菌絲體刮下，3層紗布過(guò)濾掉菌絲體，最后配置成1×107 cfu·mL-1的孢子懸浮液。用一定量的N，N-二甲基甲酰胺溶解萃取物，并用0.22 μm針頭過(guò)濾器過(guò)濾，然后與1 mL PDA充分混合，配置成山芝麻根提取物濃度分別為8、4、2、1、0.5、0.25 mg·mL-1的培養(yǎng)基，將含有山芝麻提取物的培養(yǎng)基滴于載玻片上，待凝固后，將20 μL孢子懸浮液滴于培養(yǎng)基表面，用涂布棒涂勻，涂布完成后，將載玻片放置在微生物培養(yǎng)箱中，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)6 h，含有等比例的N，N-二甲基甲酰胺的無(wú)菌水作為空白對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，按下述公式計(jì)算孢子萌發(fā)率。

孢子萌發(fā)率=（孢子萌發(fā)數(shù) / 孢子總數(shù)）×100%;

孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率=[（空白孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率）/空白孢子萌發(fā)率]×100%。

1.2.8 離體法測(cè)定山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉果實(shí)炭疽病的防治效果 將山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物溶于一定量的N，N-二甲基甲酰胺中，用0.5%吐溫-80水溶液稀釋成10 mg·mL-1的溶液。挑選成熟且形狀、大小比較一致、沒(méi)有破損和病斑的香蕉，清洗表面，晾干備用。用噴壺將溶解好的山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物溶液噴施到香蕉表面，每個(gè)香蕉噴施10 mL，用0.2 mg·mL-1的多菌靈作為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌水作為空白對(duì)照。24 h后，在香蕉表面噴灑等體積的1×107 cfu·mL-1香蕉炭疽病菌分生孢子懸浮液，將處理后的香蕉放入塑料盒中，用保鮮膜封好，28 ℃培養(yǎng)。7 d后，觀察發(fā)病情況并分級(jí)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行2次，每次實(shí)驗(yàn)9個(gè)重復(fù)。

按照以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)，即0級(jí)：無(wú)病;1級(jí)：病斑面積占果實(shí)面積的5%以下;3級(jí)：病斑面積占果實(shí)面積的6%～10%;5級(jí)：病斑面積占果實(shí)面積的11%～25%;7級(jí)：病斑面積占果實(shí)面積的26%～50%;9級(jí)：病斑面積占果實(shí)面積在50%以上。計(jì)算公式如下：

病情指數(shù)=（各級(jí)發(fā)病數(shù)×該級(jí)代表值）調(diào)查總果實(shí)數(shù)×最高級(jí)數(shù)值×100;

防治效果=對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)對(duì)照病情指數(shù)×100%。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析? 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件Excel、SPSS（Statistical Product and Service Solutions）19.0計(jì)算出R2、EC50和毒力回歸方程等數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山芝麻各相萃取物抑菌活性初篩

山芝麻各部分萃取物在1.5 mg·mL-1濃度下對(duì)10種常見(jiàn)的農(nóng)業(yè)植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果見(jiàn)表1。各相萃取物均表現(xiàn)出不同程度的菌絲生長(zhǎng)抑制活性。其中，山芝麻葉石油醚相萃取物對(duì)火龍果潰瘍病菌、蘋果輪紋病菌、香蕉炭疽病菌、葡萄灰霉病菌、番茄早疫病菌和芒果蒂腐病菌菌絲生長(zhǎng)均表現(xiàn)出一定的抑制活性，抑制率均在50%左右，對(duì)油菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最為明顯，抑制率達(dá)到83.33%;山芝麻葉正丁醇相萃取物對(duì)火龍果潰瘍病菌和芒果蒂腐病菌菌絲生長(zhǎng)具有一定的抑制活性，抑制率分別達(dá)到

51.85%和55.69%;山芝麻莖石油醚相萃取物對(duì)油菜菌核病菌、番茄早疫病菌、芒果蒂腐病菌菌絲生

長(zhǎng)具有一定的抑制活性，抑制率分別為51.17%、

46.57%、 52.61%; 山芝麻莖乙酸乙酯相萃取物對(duì)

火龍果潰瘍病菌、蘋果輪紋病菌、香蕉炭疽病菌、油菜菌核病菌和芒果蒂腐病菌菌絲生長(zhǎng)均具有一定的抑制活性，抑制率均在55%以上，對(duì)蘋果輪紋病菌、香蕉炭疽病菌、油菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最為明顯，抑制率分別為71.60%、78.91%、70.19%;山芝麻根石油醚相萃取物對(duì)火龍果潰瘍病菌、蘋果輪紋病菌、香蕉炭疽病菌、葡萄灰霉病菌和油菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)均有一定的抑制活性，其中對(duì)火龍果潰瘍病菌和香蕉炭疽病菌的抑制效果比較明顯，抑制率分別為74.59%和87.00%;

山芝麻根乙酸乙酯相萃取物對(duì)火龍果潰瘍病菌和香蕉炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)具有一定的抑制效果，其中對(duì)香蕉炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)抑制效果比較明顯，抑制率達(dá)到86.14%。

2.2 山芝麻各相萃取物對(duì)4種植物病原菌菌絲生長(zhǎng)的EC50測(cè)定

通過(guò)使用SPSS19.0軟件計(jì)算出4種萃取物對(duì)4種植物病原真菌菌絲生長(zhǎng)的EC50，結(jié)果如表2所示。山芝麻葉石油醚相萃取物對(duì)油菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50為0.703 mg·mL-1;山芝麻莖乙酸乙酯相萃取物對(duì)蘋果輪紋病菌、香蕉炭疽病菌和油菜菌核病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50分別為1.067、0.635和1.178 mg·mL-1;山芝麻根石油醚相萃取物對(duì)火龍果潰瘍病菌、蘋果輪紋病菌和香蕉炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50分別為0.945、1.149和0.062 mg·mL-1;山芝麻根乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病菌不同小寫字母表示不同濃度的孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率在0.05水平上差異顯著，不同大寫字母表示不同濃度的孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率在0.01水平上差異顯著。下同。

Different lowercase letters indicate the significant differences of inhibition rates of spore germination of different concentrations at 0.05 level， the different capital letters indicate the significant differences? of inhibition rates of spore germination of different concentrations at 0.01 level. The same below.

菌絲生長(zhǎng)的EC50為0.052 mg·mL-1。

2.3 山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率測(cè)定

山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率測(cè)定的結(jié)果如圖1和圖2所示。由圖1可知，山芝麻根石油醚相萃取物對(duì)香蕉炭疽菌分生孢子萌發(fā)具有一定的抑制活性。隨著石油醚相萃取物濃度的增加，其對(duì)香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用顯著增強(qiáng)。濃度在1、2、4和8 mg·mL-1時(shí)，孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率均在60%以上，分別為63.59%、73.13%、87.78%和92.13%，濃度為0.5和0.25 mg·mL-1時(shí)，對(duì)孢子萌發(fā)的抑制活性明顯下降，孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率分別為10.50%和9.50%。由圖2可知，山芝麻根乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)也具有一定的抑制活性。與石油醚相萃取物相比，在同等濃度下，對(duì)孢子萌發(fā)的抑制活性略差，隨著乙酸乙酯相萃相取物濃度的增加，其對(duì)香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用也成明顯上升趨勢(shì)。濃度在2、4和8 mg·mL-1時(shí)，孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率均在70%以上，分別為71.42%、81.58%和90.75%;濃度為1、0.5和0.25 mg·mL-1時(shí)，對(duì)孢子萌發(fā)的抑制活性明顯下降，孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率分別為31.86%、11.73%和2.23%。

2.4 離體法測(cè)定山芝麻石油醚相萃取物和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉果實(shí)炭疽病的防治效果

經(jīng)過(guò)山芝麻石油醚相萃取物和乙酸乙酯相萃取物處理過(guò)的香蕉，一周后仍處于輕微的發(fā)病狀態(tài)，而空白對(duì)照組的香蕉已經(jīng)出現(xiàn)大量病斑，開(kāi)始變黑腐爛（圖3）。由圖3可知，山芝麻石油醚相萃取物和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽菌的活體抑菌活性測(cè)試結(jié)果如表3所示。經(jīng)過(guò)10 mg·mL-1的山芝麻石油醚相萃取物和乙酸乙酯相萃取物處理過(guò)的香蕉的病情指數(shù)分別為24.69和35.80，而空白對(duì)照處理組的香蕉的病情指數(shù)為88.89，在10 mg·mL-1濃度下的的山芝麻石油醚相萃取物和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病的防治效果分別為72.32%和59.77%，與0.2 mg·mL-1的多菌靈相比，防治效果均好于多菌靈。

2.5 山芝麻的根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物的GC-MS分析

通過(guò)GC-MS對(duì)山芝麻根石油醚相萃取物和乙酸乙酯相萃取物進(jìn)行了分析（圖4，圖5），采用面積歸一化法進(jìn)行簡(jiǎn)單定量分析。

山芝麻根石油醚相萃取物中有36種主要化合物（表4）。從表4可以看出，酯類占14種，相對(duì)含量為21.07%;酮類占6種，相對(duì)含量為6.41%; 醇類占5種，相對(duì)含量為5.54%;酸類占5種，相對(duì)含量為4.11%;烯烴類占4種，相對(duì)含量為6.76%;烷烴類和酰胺類各占1種，相對(duì)含量分別為0.04%和0.74%。酯類含量較高的為棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯和亞油酸乙酯，相對(duì)含量分別為10.14%、2.37%、1.50%、1.39%和1.15%;酮類含量較高的為1-[2-（3-isopropylfuran-2-yl]-3-methylcyclopentyl）ethenone、2′-isopropyl-5′，6-dimethyl-7-oxaspiro? [bicyclo [4.1.0] heptane-3，1′-cyclopentan]-5-one和二苯甲酮等，相對(duì)含量分別為2.02%、1.58%和1.55%;醇類含量較高的為8-isopropyl-2，5-dimethyl-5，6，7，8-tetrahydronaphthalen-1-ol和4′，5-dimethoxy-[1，1′-biphenyl]-3-ol，相對(duì)含量分別為2.45%和1.30%;酸類含量較高的為亞油酸，相對(duì)含量為3.04%;烯烴類含量較高的為鄰二甲苯和角鯊烯，相對(duì)含量分別為3.83%和2.52%。

山芝麻根乙酸乙酯相萃取物中有17種主要化合物（表5）。從表5可以看出，酯類占8種，相對(duì)含量為19.99%;酚類占5種，相對(duì)含量為11.31%;醛類占2種，相對(duì)含量為3.38%;酸類和烯烴類各占1種，相對(duì)含量分別為1.26%和1.11%。酯類含量較高的為棕櫚酸乙酯、11-octadecenoic acid， methyl ester、亞油酸甲酯和亞油酸乙酯，相對(duì)含量分別為5.52%、4.23%、3.91%和3.62%;酚類含量較高的為苯酚、2，6-二甲氧基苯酚和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚，相對(duì)含量分別為6.91%、2.06%和1.20%;醛類含量較高的為丁香醛，相對(duì)含量為2.29%;酸類的棕櫚酸相對(duì)含量為1.26%;烯烴類的4，5，6，7-tetraethyl-1-methyl-2，3-dihydro-1H-indene相對(duì)含量為1.11%。

2.6 8種化合物對(duì)香蕉炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)抑制活性測(cè)試

通過(guò)GC-MS分析，檢測(cè)出山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物的主要成分，其中，鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、棕櫚酸乙酯、2，6-二甲氧基苯酚、亞油酸、亞油酸甲酯、亞油酸乙酯、丁香醛8種化合物相對(duì)含量較高，均在1%以上，可以認(rèn)為這8種物質(zhì)為這兩種萃取物中的主要物質(zhì)。山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)抑制活性最好（表2），故作為這8種化合物的篩選靶標(biāo)，測(cè)試這8種化合物對(duì)香蕉炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)抑制活性。由表6可知，在100 μg·mL-1濃度下，鄰苯二甲酸二異丁酯和鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)香蕉炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)表現(xiàn)出較高的抑制活性，抑制率分別為65.12%和68.07%，EC50分別為56.66和37.04 μg·mL-1。

3 討論與結(jié)論

在醫(yī)藥領(lǐng)域，關(guān)于山芝麻的化學(xué)成分和藥用價(jià)值的相關(guān)研究報(bào)道已經(jīng)有很多了，這些研究報(bào)道已經(jīng)證實(shí)山芝麻具有抗菌、抗糖尿病、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)功能、抗腫瘤等活性（Wang & Liu， 1987; Chang et al.， 2001）， 但關(guān)于山芝麻在農(nóng)用方面的抑菌效果及其抑菌成分的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究用95%乙醇對(duì)山芝麻根、莖和葉進(jìn)行浸提，并用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對(duì)山芝麻乙醇提取物進(jìn)行萃取，對(duì)山芝麻各相萃取物進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)。

研究發(fā)現(xiàn)，山芝麻根部提取物的抑菌活性要高于莖部和葉部，這說(shuō)明山芝麻根、莖、葉三部分所含的抑菌活性物質(zhì)有所不同，其中，山芝麻根部石油醚相和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病菌菌絲的生長(zhǎng)抑制效果較明顯，抑制率均在80%以上;在測(cè)試孢子萌發(fā)抑制活性實(shí)驗(yàn)中，濃度在2、4和8 mg·mL-1時(shí)，山芝麻根部石油醚相和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)相對(duì)抑制率均在70%以上，這說(shuō)明山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物不僅僅能抑制香蕉炭疽病菌菌絲的生長(zhǎng)，還能對(duì)香蕉炭疽病菌分生孢子萌發(fā)起到一定的抑制作用;在離體果實(shí)病害防治實(shí)驗(yàn)中， 山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病表現(xiàn)出較好的防治效果，在10 mg·mL-1濃度下的山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉炭疽病的防治效果分別為72.32%和59.77%，其防治效果均好于0.2 mg·mL-1的多菌靈，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以說(shuō)明，山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物對(duì)香蕉果實(shí)具有一定的保護(hù)作用，在未來(lái)具有發(fā)展成一種水果保鮮劑的潛力。

為進(jìn)一步研究山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物的抑菌成分，采用氣相與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)這兩種萃取物進(jìn)行了分析。其中，山芝麻根石油醚相萃取物中有36種主要化學(xué)成分，主要成分為棕櫚酸乙酯（10.14%）、鄰二甲苯（3.83%）、亞油酸（3.04%）、角鯊烯（2.52%）、鄰苯二甲酸二丁酯（1.50%）、鄰苯二甲酸二異丁酯（1.39%）、亞油酸乙酯（1.15%）等;山芝麻根乙酸乙酯相萃取物中有17種主要化學(xué)成分， 分別為苯酚（6.91%）、棕櫚酸乙酯（5.52%）、亞油酸甲酯（3.91%）、亞油酸乙酯（3.62%）、丁香醛（2.29%）、棕櫚酸（1.26%）、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（1.20%）等。選取山芝麻根石油醚相和乙酸乙酯相萃取物中8種主要化合物，以香蕉炭疽病菌作為靶標(biāo)，進(jìn)行了菌絲生長(zhǎng)抑制活性測(cè)試。其中，在100 μg·mL-1濃度下，鄰苯二甲酸二異丁酯和鄰苯二甲酸二丁酯對(duì)香蕉炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)抑制活性顯現(xiàn)出較高的抑制活性，EC50分別為56.66和37.04 μg·mL-1。雖然抑菌活性并不是特別理想，但可以說(shuō)明，這兩種化合物有可能是提取物中的抑菌活性成分，為從山芝麻中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)抑菌活性先導(dǎo)化合物和開(kāi)發(fā)植物源殺菌劑提供理論依據(jù)。

LIU QW， GE XD， CHEN LG， et al.， 2018. Purification and analysis of the composition and antioxidant activity of polysaccharides from Helicteres angustifolia L. [J]. Int J Biol Macromol， 107（Part B）： 2262-2268.

PAN MH， CHEN CM， LEE SW， et al.， 2008. Cytotoxic triterpenoids from the root bark of Helicteres angustifolia [J]. Chem Biodivers， 5： 565-574.

SUN S， LI KJ， LEI ZF， et al.， 2018. Immunomodulatory activity of polysaccharide from helicteres angustifolia L. on 4t1 tumor-bearing mice [J]. Biomed Pharmacother， 101： 881-888.

SUN S， LI K， XIAO L， et al.， 2019. Characterization of polysaccharide from Helicteres angustifolia L. and its immunomodulatory activities on macrophages raw264.7 [J]. Biomed Pharmacother， 109： 262-270.

WANG MS， LIU WG， 1987. A naphthoquinone from Helicteres angustifolia [J]. Phytochemistry， 26（2）： 578-579.

WANG GC， LI T， WEI YR， et al.， 2012. Two pregnane deri-vatives and a quinolone alkaloid from Helicteres angustifolia [J]. Fitoterapia， 83（8）： 1643-1647.

WEI YR， WANG GC， ZHANG XQ， et al.， 2011. Studies on chemical constituents in roots of Helicteres angustifolia [J]. Chin J Chin Mat Med， 36（9）： 1193-1197.? [魏映柔， 王國(guó)才， 張曉琦， 等， 2011.? 山芝麻化學(xué)成分研究 [J].? 中國(guó)中藥雜志， 36（9）：1193-1197.]

WU WJ， 1987. Introduction to experimental techniques for plant chemical protection [M]. Xian： Shanxi Science and Technology Press： 141-145.? [吳文君， 1987. 植物化學(xué)保護(hù)實(shí)驗(yàn)技術(shù)導(dǎo)論 [M]. 西安：陜西科學(xué)技術(shù)出版社：141-145.]

YANG X， LEI Z， YU Y， et al.， 2019. Phytochemical characteristics of callus suspension culture of Helicteres angustifolia L. and its in vitro antioxidant， antidiabetic and immunomo-dulatory activities [J]. S Afr J Bot， 121： 178-185.

（責(zé)任編輯 何永艷）