羅海清 江丹賢 楊東紅 陳正魯 鐘宇南 陳梓宏 余忠華

[摘要] 目的 探討長(zhǎng)鏈非編碼RNA生長(zhǎng)停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5（lncRNA-GAS5）在鼻咽癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。 方法 收集2013年3月～2018年12月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院鼻咽癌組織標(biāo)本56例為鼻咽癌組，正常鼻咽組織標(biāo)本42例為對(duì)照組。qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)lncRNA-GAS5在兩組的表達(dá)水平，分析lncRNA-GAS5的表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性。 結(jié)果 鼻咽癌組lncRNA-GAS5相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度與lncRNA-GAS5的表達(dá)水平密切相關(guān)（P < 0.05）。lncRNA-GAS5高表達(dá)患者的生存期顯著高于低表達(dá)（P < 0.01）。 結(jié)論 lncRNA-GAS5 在鼻咽癌組織中表達(dá)降低，可能成為鼻咽癌患者新的預(yù)后因子。

[關(guān)鍵詞] 鼻咽癌;長(zhǎng)鏈非編碼RNA;長(zhǎng)鏈非編碼RNA生長(zhǎng)停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5;預(yù)后

[中圖分類號(hào)] R739.63? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）05（b）-0102-04

Expression of lncRNA-GAS5 and its clinical significance in nasopharyngeal carcinoma

LUO Haiqing? ?JIANG Danxian? ?YANG Donghong? ?CHEN Zhenglu? ?ZHONG Yu′nan? ?CHEN Zihong? ?YU Zhonghua

Nasopharyngeal Carcinoma Area， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Guangdong Province， Zhanjiang? ?524001， China

[Abstract] Objective To investigate the expression of long non-coding RNA-growth arrest-specific 5 （lncRNA-GAS5） in nasopharyngeal carcinoma and to evaluate its clinical significance. Methods From March 2013 and December 2018， 56 cases with nasopharyngeal carcinoma tissue samples from Affiliated Hospital of Guangdong Medical University were collected as nasopharyngeal carcinoma group， and 42 cases of normal nasopharyngeal tissue samples were collected as control group. The expression of lncRNA-GAS5 was detected by qRT-PCR. The correlations between the expression of lncRNA-GAS5 and pathological characteristics and prognostic were analyzed. Results The relative expression of lncRNA-GAS5 in nasopharyngeal carcinoma group was lower than that in control group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. TNM stage， lymph node metastasis and tumor differentiation were closely related to the expression level of lncRNA-GAS5 （P < 0.05）. The survival of patients with high expression of lncRNA-GAS5 was significantly higher than patients with low expression （P < 0.01）. Conclusion The expression of lncRNA-GAS5 is down-regulated in nasopharyngeal carcinoma tissues and may serve as a potential new prognostic for nasopharyngeal carcinoma.

[Key words] Nasopharyngeal carcinoma; Long non-coding RNA; Long non-coding RNA-growth arrest-specific 5; Prognosis

鼻咽癌俗稱廣東癌，是華南地區(qū)最常見的惡性腫瘤。鼻咽癌與EB病毒感染、遺傳因素相關(guān)[1-3]。早期鼻咽癌以放療為主，5年總生存（OS）率達(dá)95%以上;局部晚期鼻咽癌以同步放化療為主，5年OS率達(dá)80%[4-5];晚期鼻咽癌預(yù)后差，以全身系統(tǒng)化療為主，5年OS率只有10%[6-7]。因此，提高鼻咽癌的早篩查、早診斷以及患者生存預(yù)后判斷具有重要的臨床意義[8]。LncRNA通常定義為>200個(gè)核苷酸的RNA，可以調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展。長(zhǎng)鏈非編碼RNA生長(zhǎng)停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5（lncRNA-GAS5）屬于lncRNA，位于人類基因組1號(hào)染色體上，具有調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等作用[9]，lncRNA-GAS5在結(jié)腸癌[10]、胃癌[11]中具有抑癌基因的作用，并且是上述惡性腫瘤的獨(dú)立預(yù)后因子。但有關(guān)lncRNA-GAS5在鼻咽癌中的作用機(jī)制，目前少見報(bào)道。本研究通過(guò)探討lncRNA-GAS5在鼻咽癌患者組織中表達(dá)及其表達(dá)水平與患者臨床病理特征、預(yù)后的相關(guān)性，為鼻咽癌的早期診斷、預(yù)后判斷提供新的生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年3月～2018年12月廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）鼻咽癌組織標(biāo)本56例為鼻咽癌組，正常鼻咽組織標(biāo)本42例為對(duì)照組。鼻咽癌患者確診依據(jù)病理診斷，臨床分期采用2008年中國(guó)鼻咽癌分期版本[12]。鼻咽癌組均未行常規(guī)治療，男36例，女20例;年齡17～72歲，平均（48.01±6.01）歲。對(duì)照組，男27名，女15名;年齡18～68歲，平均（45.23±5.68）歲。兩組性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器

本研究引物由上海吉瑪科技有限公司合成。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（型號(hào)：4392938）、qRT-PCR試劑盒（型號(hào)：4458236）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3 方法

鼻內(nèi)鏡活檢組織采用Trizol試劑提取RNA，經(jīng)純度與濃度檢測(cè)后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR試劑盒擴(kuò)增lncRNA-GAS5基因。lncRNA-GAS5正向引物：5′-CTTCTGGGCTCAAGTGATCCT-3′;反向引物：5′-TT-GTGCCATGAGACTCCATCAG-3′。GAPDH正向引物：5′-CATGAGCAGTAAACA GCCATGAT-3′;反向引物：5′-AGTACACCCATCGAATTCCAGT-3′。qRT-PCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)定量PCR儀上完成，并選用ddCt相對(duì)定量法分析各目標(biāo)基因的mRNA表達(dá)量。PCR反應(yīng)體系共20 μL：1 μmol/L的上下游引物混合物0.5 μL，cDNA 1 μL，Taq酶0.5 μL，SYBR-Green 1 μL，Buffer 2 μL，dNTPs 1 μL，去離子水14 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 觀察指標(biāo)

鼻咽癌組采用門診、電話等形式進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間截至2019年12月，患者隨訪時(shí)間10～66個(gè)月，中位隨訪時(shí)間39個(gè)月。以鼻咽癌組織lncRNA-GAS5相對(duì)表達(dá)量的均值為臨界值，高于臨界值為高表達(dá)，低于或等于臨界值為低表達(dá)。比較lncRNA-GAS5高表達(dá)與低表達(dá)患者的生存時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn);生存分析采用Kaplan-Meier分析，生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組lncRNA-GAS5表達(dá)水平比較

鼻咽癌組lncRNA-GAS5相對(duì)表達(dá)量（3.63±1.16）低于對(duì)照組（6.12±1.46），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 9.407，P < 0.05）。

2.2 lncRNA-GAS5表達(dá)水平與鼻咽癌患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度與lncRNA-GAS5的表達(dá)水平密切相關(guān)（P < 0.05）。見表1。

2.3 lncRNA-GAS5表達(dá)水平與鼻咽癌患者生存預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier結(jié)果顯示，lncRNA-GAS5高表達(dá)患者的生存期顯著高于低表達(dá)（P < 0.01）。lncRNA-GAS5高表達(dá)和低表達(dá)的中位OS分別為54.3、40.1個(gè)月。見圖1。

3 討論

鼻咽癌是華南地區(qū)最常見的惡性腫瘤，早期癥狀多隱匿，多數(shù)患者就診時(shí)已屬于局部晚期。鼻咽癌患者的預(yù)后欠佳，中晚期鼻咽癌患者5年生存率只有20%～30%，其主要原因是鼻咽癌的早期診斷缺乏有效的手段[13]。因此，尋找鼻咽癌早期篩查和預(yù)后判斷的有效手段對(duì)于提高鼻咽癌的有效治療具有重要意義。本研究旨在篩選鼻咽癌的新的預(yù)后因子，為鼻咽癌的預(yù)后判斷以及個(gè)體化治療提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

近年來(lái)，大量文獻(xiàn)報(bào)道lncRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切相關(guān)，lncRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移相關(guān)[14-15]。LncRNA-GAS5為近年發(fā)現(xiàn)的具有腫瘤抑制功能的lncRNA，在大多數(shù)腫瘤如乳腺癌[16]、結(jié)腸癌[17]、胃癌[18]等中呈低表達(dá)，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等途徑發(fā)揮抑癌基因效應(yīng)。另外研究提示，lncRNA-GAS5的表達(dá)水平與多種腫瘤預(yù)后有顯著相關(guān)性[19-20]。Song等[21]研究顯示，lncRNA-GAS5表達(dá)水平越高的腫瘤患者OS越好。Guo等[22]研究了甲狀腺癌組織及甲狀腺瘤患者lncRNA-GAS5的表達(dá)，結(jié)果顯示甲狀腺癌組織中l(wèi)ncRNA-GAS5的表達(dá)較甲狀腺瘤患者的顯著降低，且lncRNA-GAS5表達(dá)水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，lncRNA-GAS5表達(dá)量與患者預(yù)后密切相關(guān)，表達(dá)量越低患者的生存期越短。徐瀚斌等[23]檢測(cè)了胃癌組織標(biāo)本中l(wèi)ncRNA-GAS5表達(dá)情況，并分析其表達(dá)變化與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示胃癌組織中l(wèi)ncRNA-GAS5相對(duì)表達(dá)量均明顯低于癌旁組織，且lncRNA-GAS5表達(dá)與組織分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。lncRNA-GAS5高表達(dá)者生存時(shí)間均明顯長(zhǎng)于低表達(dá)者。lncRNA-GAS5除了可作為抑癌基因，其表達(dá)水平與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)外，還可作為miRNA的誘餌，模擬分子海綿的吸附作用，通過(guò)靶向結(jié)合miRNA負(fù)性調(diào)控miRNA下游靶基因的表達(dá)[24-25]。Zhao等[26]發(fā)現(xiàn)lncRNA-GAS5可通過(guò)“海綿樣”作用吸附miR-222，誘導(dǎo)腫瘤抑制因子Bcl-2修飾因子的表達(dá)，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

本研究分析了lncRNA-GAS5在鼻咽癌組織中的表達(dá)水平與鼻咽癌患者臨床病理特征以及患者預(yù)后的相關(guān)性。目前尚未見lncRNA-GAS5在鼻咽癌組織中表達(dá)的報(bào)道。因此，本研究具有一定的創(chuàng)新性。研究結(jié)果顯示，lncRNA-GAS5在鼻咽癌組織中的表達(dá)顯著低于正常鼻咽組織，lncRNA-GAS5在鼻咽癌組織中的表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度密切相關(guān)。提示lncRNA-GAS5表達(dá)下調(diào)可能參與了鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。生存分析顯示，lncRNA-GAS5表達(dá)越低的患者預(yù)后越差，lncRNA-GAS5可作為鼻咽癌患者生存預(yù)后的標(biāo)志。與徐瀚斌等[23]的報(bào)道相一致。

綜上所述，lncRNA-GAS5與鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，lncRNA-GAS5在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中可能起著抑癌基因的作用，另外鼻咽癌患者lncRNA-GAS5表達(dá)越低，惡性程度越高，患者預(yù)后越差。因此lncRNA-GAS5不僅參與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控，還可作為判斷鼻咽癌預(yù)后的一個(gè)重要的獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。未來(lái)，本課題組將進(jìn)一步研究lncRNA-GAS5的模擬分子海綿的吸附作用，與相關(guān)的靶向miRNA結(jié)合調(diào)控鼻咽癌發(fā)生進(jìn)展的具體作用機(jī)制。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Lung RW，Hau PM，Yu KH，et al. EBV-encoded miRNAs target ATM-mediated response in nasopharyngeal carcinoma [J]. J Pathol，2018，244（4）：394-407.

[2]? Paul P，Deka H，Malakar AK，et al. Nasopharyngeal carcinoma：understanding its molecular biology at a fine scale [J]. Eur J Cancer Prev，2018，27（1）：33-41.

[3]? Wu J，Su H，Li G，et al. Epstein-Barr virus latent membrane protein 1 （LMP1） regulates the aldehyde dehydrogenase（ALDH）positive cell population in nasopharyngeal carcinoma cell lines [J]. Acta Virol，2019，63（3）：322-327.

[4]? Tan LP，Tan GW，Sivanesan VM，et al. Systematic comparison of plasma EBV DNA，anti-EBV antibodies and miRNA levels for early detection and prognosis of nasopharyngeal carcinoma [J]. Int J Cancer，2020，146（8）：2336-2347.

[5]? Ng WT，Corry J，Langendijk JA，et al. Current management of stage Ⅳ nasopharyngeal carcinoma without distant metastasis [J]. Cancer Treat Rev，2020，85：101995.

[6]? Fang W，Yang Y，Ma Y，et al. Camrelizumab（SHR-1210）alone or in combination with gemcitabine plus cisplatin for nasopharyngeal carcinoma：results from two single-arm，phase 1 trials [J]. Lancet Oncol，2018，19（10）：1338-1350.

[7]? Zeng Y，Chen H，Xiang Z，et al. Nasopharyngeal carcinoma with metastasis to the central nervous system：a report of two patients and review of the literature [J]. Int J Clin Exp Pathol，2019，12（11）：4142-4149.

[8]? He B，Zeng J，Chao W，et al. Serum long non-coding RNAs MALAT1，AFAP1-AS1 and AL359062 as diagnostic and prognostic biomarkers for nasopharyngeal carcinoma [J]. Oncotarget，2017，8（25）：41166-41177.

[9]? Liu Q，Yu W，Zhu S，et al. Long noncoding RNA GAS5 regulates the proliferation，migration，and invasion of glioma cells by negatively regulating miR-18a-5p [J]. J Cell Physiol，2018，234（1）：757-768.

[10]? Song J，Shu H，Zhang L，et al. Long noncoding RNA GAS5 inhibits angiogenesis and metastasis of colorectal cancer through the Wnt/β-catenin signaling pathway [J]. J Cell Biochem，2019，125（5）：6937-6951.

[11]? Li W，Peng X，Wang Z，et al. The Long Noncoding RNA，Growth Arrest-Specific 5，Suppresses Gastric Cancer by Downregulating miR-21 Expression [J]. Pharmacology，2020，7：1-11.

[12]? 黃軍榮，張純，張玉蘭，等.基于2008分期標(biāo)準(zhǔn)的PET/CT與MR對(duì)鼻咽癌T分期的差異[J].廣東醫(yī)學(xué)，2014， 35（1）：18-21.

[13]? Wang P，Xiao Z，Tang Z，et al. Dual-energy CT in the differentiation of stage T1 nasopharyngeal carcinoma and lymphoid hyperplasia [J]. Eur J Radiol，2020，124：108824.

[14]? Kopp F，Mendell JT. Functional Classification and Experimental Dissection of Long Noncoding RNAs [J]. Cell，2018，172（3）：393-407.

[15]? Peng WX，Koirala P，Mo YY. LncRNA-mediated regulation of cell signaling in cancer [J]. Oncogene，2017，36（41）：5661-5667.

[16]? Li J，Li L，Yuan H，et al. Up-regulated lncRNA GAS5 promotes chemosensitivity and apoptosis of triple-negative breast cancer cells [J]. Cell Cycle，2019，18（16）：1965-1975.

[17]? Cheng K，Zhao Z，Wang G，et al. lncRNA GAS5 inhibits colorectal cancer cell proliferation via the miR 182 5p/FOXO3a axis [J]. Oncol Rep，2018，40（4）：2371-2380.

[18]? Liu Y，Yin L，Chen C，et al. Long non-coding RNA GAS5 inhibits migration and invasion in gastric cancer via interacting with p53 protein [J]. Dig Liver Dis，2020， 52（3）：331-338.

[19]? Kamel LM，Atef DM，Mackawy AMH，et al. Circulating long non-coding RNA GAS5 and SOX2OT as potential biomarkers for diagnosis and prognosis of non-small cell lung cancer [J]. Biotechnol Appl Biochem，2019，66（4）：634-642.

[20]? Cao Q，Wang N，Qi J，et al. Long non-coding RNA-GAS5 acts as a tumor suppressor in bladder transitional cell carcinoma via regulation of chemokine（C-C motif） ligand 1 expression [J]. Mol Med Rep，2016，13（1）：27-34.

[21]? Song W，Wang K，Zhang RJ，et al. Long noncoding RNA GAS5 can predict metastasis and poor prognosis：a meta-analysis [J]. Minerva Med，2016，107（1）：70-76.

[22]? Guo LJ，Zhang S，Gao B，et al. Low expression of long non-coding RNA GAS5 is associated with poor prognosis of patients with thyroid cancer [J]. Exp Mol Pathol，2017， 102（3）：500-504.

[23]? 徐瀚斌，章由賢，劉放，等.胃癌組織lncRNA MEG3、GAS5表達(dá)變化及其與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系[J].山東醫(yī)藥，2019，59（10）：6-9.

[24]? Zhao P，Cui X，Zhao L，et al. Overexpression of Growth-Arrest-Specific Transcript 5 Improved Cisplatin Sensitivity in Hepatocellular Carcinoma Through Sponging miR-222 [J]. DNA Cell Biol，2020，39（4）：724-732.

[25]? Jing Z，Gao L，Wang H，et al. Long non-coding RNA GAS5 regulates human B lymphocytic leukaemia tumourigenesis and metastasis by sponging miR-222 [J]. Cancer Biomark，2019，26（3）：385-392.

[26]? Zhao X，Wang P，Liu J，et al. Gas5 Exerts Tumor-suppressive Functions in Human Glioma Cells by Targeting miR-222 [J]. Mol Ther，2015，23（12）：1899-1911.

（收稿日期：2020-02-14? 本文編輯：劉明玉）