白桂杰，張同存，校海霞

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院 300457； 2.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 300308）

犬瘟熱病毒（CDV）是引發(fā)犬瘟熱疾病的高致病性病原體，CDV 的感染性較強(qiáng)， 致病率較高。 主要的自然宿主包括犬科動(dòng)物、熊貓科動(dòng)物和靈長(zhǎng)目動(dòng)物等。 CDV 會(huì)通過(guò)呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)和神經(jīng)中樞系統(tǒng)進(jìn)行傳播，可使動(dòng)物出現(xiàn)卡他性炎癥或者神經(jīng)性癥狀等[1]。 目前發(fā)現(xiàn)的CDV 基因型有17 種[2]，亞洲地區(qū)主要流行Asia 型，在我國(guó)流行的CDV 基因型主要為Asia 1型和Asia 2 型[3-4]。 近些年來(lái)，犬瘟熱疾病的發(fā)病趨勢(shì)逐年遞增，這給我國(guó)的毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)和飼養(yǎng)寵物數(shù)量比較多的城市帶來(lái)了巨大經(jīng)濟(jì)損失。

CDV 屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbillivirus），是無(wú)節(jié)段的負(fù)鏈單股RNA 病毒，該病毒的基因組呈線狀分布[5-7]，主要編碼六種結(jié)構(gòu)蛋白[8-10]，其中融合蛋白（F）對(duì)于CDV 在侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程中具有重要意義。 副黏病毒科的F蛋白不僅促進(jìn)病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合， 還使細(xì)胞間發(fā)生膜融合形成合胞體[11]。 F 蛋白最初以F0形式存在，通過(guò)胞內(nèi)酶裂解成由二硫鍵連接的F1和F2兩個(gè)單元，同時(shí)F1形成新的N 端，稱為融合肽（FP）。 在CDV-F 所介導(dǎo)的膜融合過(guò)程中，吸附蛋白（H）與細(xì)胞表面的受體結(jié)合使F 蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)重排，F(xiàn) 蛋白的兩個(gè)七肽重復(fù)域（HR）會(huì)形成六螺旋束[12]，處于六螺旋束上的FP 靠近細(xì)胞膜促使病毒侵入細(xì)胞內(nèi)。 有研究表明CDV-F 蛋白與副黏病毒科其他病毒F 蛋白序列同源性為70%～80%[13]，因此，F(xiàn) 蛋白具有高保守性這一特點(diǎn)可以作為研制F 蛋白的犬瘟熱特異性單克隆單體的前提條件。 本研究通過(guò)克隆CDV-F 蛋白胞外段基因、構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒、表達(dá)純化CDV-F 蛋白以及抗原性鑒定等實(shí)驗(yàn)為CDV 抗原蛋白的免疫學(xué)性質(zhì)的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒載體、細(xì)菌和細(xì)胞

大腸桿菌感受態(tài)Ecoli.DH-5α 菌株購(gòu)自康維世紀(jì)生物有限公司；pFuse 載體和293T 細(xì)胞均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室留存。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Pfu DNA 聚合酶及10 × Pfu buffer，dNTP 均購(gòu)于天根生物有限公司；EcoR I、Xho I 等限制性內(nèi)切酶、T4 連接酶、Zeocin 抗生素均購(gòu)于Thermo Fisher 公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購(gòu)于康維世紀(jì)生物有限公司；PEI 購(gòu)于Alfa Aesar 公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)于英維捷基貿(mào)易有限公司、胰酶、胎牛血清均購(gòu)于博奧瑞京科技發(fā)展有限公司；彩色預(yù)染蛋白Marker 購(gòu)于柏奧易杰（北京） 科技有限公司；Anti-His 鼠單克隆抗體、 辣根過(guò)氧化物酶（HRP） 標(biāo)記的山羊抗鼠單克隆抗體均購(gòu)于天津三箭生物科技有限股份公司； 世紀(jì)元亨犬瘟熱單克隆抗體產(chǎn)于北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司； 吉林五星犬瘟熱單克隆抗體產(chǎn)于吉林五星生命源高科有限公司；HisTrapTM5mL 預(yù)裝柱、Superdex 200 10/300GL 均購(gòu)于GE Healthcare 公司；TMB 顯色液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；CDV-sF 質(zhì)粒以及特異性引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3 真核表達(dá)質(zhì)粒pFuse-CDV-sF-ecto 的構(gòu)建

由于CDV-F 的氨基酸序列與MeV-F 蛋白的同源性高達(dá)71.4%，重組質(zhì)粒pFuse-CDV-sF-ecto 是根據(jù)麻疹病毒融合蛋白的序列信息構(gòu)建的，本次研究中設(shè)計(jì)的CDV-F 蛋白胞外段序列是第132 位氨基酸至第594 位氨基酸。以CDV-sF 克隆質(zhì)粒為模板，在目的基因CDV-sF-ecto 的C 末端引入突變，加入His 標(biāo)簽基因，利用引物P1 和P2 擴(kuò)增目的基因，然后將克隆片段連接到pFuse 載體上得到重組質(zhì)粒， 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)DH-5α，挑取單克隆至5mL LB 培養(yǎng)基，提取質(zhì)粒后37℃條件下進(jìn)行雙酶切（EcoR I 內(nèi)切酶和Xho I 內(nèi)切酶）鑒定，酶切結(jié)果正確的質(zhì)粒送去測(cè)序，將序列正確的重組質(zhì)粒命名為pFuse-CDV-sF-ecto。 利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物，所用引物如下：

上 游 引 物 P1：5’ -GAATTCGTGCTCCAAGGCCCAGATCCACTGG-3’（含EcoR I 酶 切 位 點(diǎn)）； 下 游 引 物P2：5’-GGCTAGCTCAATGGTGATGGTGGTGATGGCC-3’（含Xho I 酶 切 位點(diǎn)）。

1.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞

293T 細(xì)胞是由含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)， 在轉(zhuǎn)染的前一天進(jìn)行傳代， 細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～80%時(shí)， 將pFuse-CDV-sF-ecto 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞。 向2 個(gè)1.5mL EP 管中分別加入30μg 質(zhì)粒和90μL PEI（1mg/mL），再分別補(bǔ)充適量的1 × PBS，靜置5min，將兩管混勻靜置20min，將混合液加入293T 細(xì)胞的培養(yǎng)皿中， 培養(yǎng)4～6h 后將原有培養(yǎng)基換成無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)基。 培養(yǎng)3～4d 后收集細(xì)胞上清。

1.5 Western Blot 檢測(cè)

驗(yàn)證目的蛋白是否表達(dá)，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清進(jìn)行離心濃縮，經(jīng)SDS-PAGE 電泳跑膠之后， 將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC 膜）上。 用5%脫脂牛奶封閉；用TBST 洗膜；一抗為Anti-His 鼠單克隆抗體； 二抗為HRP-山羊抗鼠單克隆抗體； 最后用Western Blot 顯色試劑進(jìn)行顯色分析。

1.6 目的蛋白的表達(dá)與純化

收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清，4℃12000r/min 離心30～40min，除去細(xì)胞沉淀， 上清經(jīng)0.22μm 濾膜抽濾后， 通過(guò)蠕動(dòng)泵過(guò)夜過(guò)HisTrapTM5mL 預(yù)裝柱， 然后用AKTA 儀器進(jìn)行蛋白純化， 利用20mmol/L Tris、50mmol/L NaCl、300mmol/L 咪唑的洗脫緩沖液按照咪唑梯度洗脫方法收集目的蛋白。 將目的蛋白進(jìn)行濃縮，500μL Loop 環(huán)上樣，用Superdex 200 10/300 GL 分子篩進(jìn)一步純化，根據(jù)出峰位置收集蛋白，將蛋白樣品進(jìn)行制樣，用12% SDSPAGE 膠跑膠鑒定。

1.7 ELISA 鑒定

將CDV-sF-ecto 蛋白按200ng/孔包被到96 孔板上，4℃包被過(guò)夜。 次日用3% BSA 封閉，PBST 進(jìn)行洗板，一抗分別為世紀(jì)元亨犬瘟熱單克隆抗體、 吉林五星犬瘟熱單克隆抗體 （陰性對(duì)照）、Anti-His 鼠單克隆抗體， 以2 倍倍比梯度稀釋； 二抗為HRP-山羊抗鼠單克隆抗體； 洗板之后加入TMB 顯色液顯色，再加入50μL 2 M H2SO4終止反應(yīng)； 用酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 5 軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的克隆與酶切鑒定

以CDV-sF 質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR 擴(kuò)增出來(lái)帶有His 標(biāo)簽的CDV-sF-ecto 基因，1%瓊脂糖凝膠電泳跑膠后， 在1487bp 處顯示有條帶（圖1），且條帶大小與目的片段大小相符。 將擴(kuò)增片段用EcoR I 和Xho I 限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶酶切之后連接到pFuse 載體上， 構(gòu)建好重組質(zhì)粒命名為pFuse-CDV-sF-ecto。 用EcoR I 和Xho I 限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切驗(yàn)證（圖2），結(jié)果顯示酶切下的片段大小與目的片段大小相符。

圖1. 以CDV-sF 為模板的PCR 擴(kuò)增

圖2. EcoR I 內(nèi)切酶和Xho I 內(nèi)切酶進(jìn)行重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證

2.2 Western Blot 檢測(cè)

細(xì)胞上清經(jīng)SDS-PAGE 電泳跑膠， 將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上， 經(jīng)Anti-His 鼠單克隆抗體和HRP-羊抗鼠單克隆抗體先后孵育后進(jìn)行顯色分析。 結(jié)果表明，在變性條件下，44 KD 左右處有條帶出現(xiàn)， 即F1 蛋白； 在非變性條件下，60 KD（F0）、120 KD（Dimer）、180 KD 以 上（Oligomer）的 位 置 都 有 條 帶 出 現(xiàn)（圖3）。 表明CDV-sF-ecto 蛋白是以不同的聚集形式存在的。

圖3. CDV-sF-ecto 蛋白的Western Blot 分析

2.3 蛋白的表達(dá)純化

將收集的細(xì)胞上清經(jīng)抽濾后，過(guò)鎳離子層析柱，蛋白洗脫下來(lái)的條件為20mmol/L Tris、50mmol/L NaCl、70mmol/L 咪唑，收集濃縮，過(guò)分子篩層析純化，在多聚體位置（8.43 mL）出峰（圖4），得到0.2mg 目的蛋白。 將蛋白制樣進(jìn)行SDS-PAGE 跑膠，結(jié)果如下（圖4），表明所表達(dá)的CDV-sF-ecto 蛋白主要以寡聚體形式存在。

圖4. CDV-sF-ecto 分子篩層析純化結(jié)果

圖5. CDV-sF-ecto 蛋白的ELISA 鑒定

2.4 ELISA 鑒定

將CDV-sF-ecto 蛋白包被到酶標(biāo)板， 以世紀(jì)元亨犬瘟熱商業(yè)化單克隆抗體、 吉林五星犬瘟熱商業(yè)化單克隆抗體 （陰性對(duì)照）、Anti-His 鼠單克隆抗體分別為一抗進(jìn)行鑒定。 結(jié)果顯示CDV-sF-ecto 蛋白可特異性結(jié)合世紀(jì)元亨犬瘟熱單克隆抗體和Anti-His 鼠單克隆抗體，EC50 的值分別為29.35μg/mL、0.07μg/mL（圖5）。

3 討論

近年來(lái)，隨著寵物犬和毛皮制造廠家的數(shù)量增多，犬瘟熱疾病感染趨勢(shì)呈現(xiàn)上升狀態(tài)。 目前還未出現(xiàn)有效的治療手段，接種疫苗是主要的預(yù)防措施， 但疫苗接種后會(huì)有母源抗原干擾等缺點(diǎn)。 所以，僅在預(yù)防接種階段采取措施還是不夠的，還要在控制病情發(fā)展等方面做出努力， 因此研制出針對(duì)保守的F 蛋白的單克隆抗體也是可以提高免疫控制的有效手段之一。 目前市場(chǎng)上的犬瘟熱單克隆抗體都是鼠源的，而且抗體特異性不確定，研制關(guān)于F 蛋白的犬源化的犬瘟熱特異性單克隆抗體， 不僅排除母體抗原的干擾，還可以增強(qiáng)抗體的特異性，從而提高治療效果。

犬瘟熱病毒F 蛋白在CDV 與宿主之間起到 “搭橋牽線”的作用，對(duì)于CDV 的感染是至關(guān)重要的，F(xiàn) 蛋白在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量雖不高，但能夠使蛋白進(jìn)行正確的糖基化修飾，有利于對(duì)F 蛋白結(jié)構(gòu)以及抗原表位的研究，F(xiàn) 蛋白的結(jié)構(gòu)解析也有利于抗體研究的進(jìn)一步發(fā)展。

4 小結(jié)

本研究成功表達(dá)了CDV-F 蛋白的胞外段，ELISA 結(jié)果表明該蛋白與犬瘟熱病毒特異性單克隆抗體的結(jié)合活性較高。F 蛋白作為CDV 最重要的抗原蛋白之一，對(duì)于其功能和結(jié)構(gòu)的解析都是至關(guān)重要的， 了解F 蛋白的免疫原性和作用機(jī)制可以為犬瘟熱疾病的變異機(jī)制和有效治療手段的研究奠定基礎(chǔ)[Barrett,1985 #14]。