彭麗娜, 潘雅君, 張 曼, 谷佳男, 徐汪節(jié)

(1. 上海交通大學(xué)實驗動物中心, 上海 200240;2. 上海市西南位育中學(xué)國際部, 上海 200233)

嗜肺巴斯德桿菌(Pasteurella pneumophila)在自然界中分布廣泛，它有兩種生物型，分別被命名為“Jawetz”和“Heyl”，主要感染嚙齒類動物，對實驗小鼠、大鼠和豚鼠的危害較大[1]。嗜肺巴斯德桿菌作為一種條件致病菌，能夠引起免疫缺陷動物或免疫功能低下的動物產(chǎn)生嚴(yán)重的肺炎，并可能導(dǎo)致動物死亡。該菌也是人獸共患病原，可引起人的局部和全身感染[2-3]。實驗動物及其設(shè)施內(nèi)污染嗜肺巴斯德桿菌后很難去除，給飼養(yǎng)管理和動物實驗帶來了很多干擾[4]。該菌是國家標(biāo)準(zhǔn)《實驗動物 微生物學(xué)等級及監(jiān)測》14922.2—2011 中SPF 級嚙齒類實驗動物必須排除的病原菌之一[5]。

國家標(biāo)準(zhǔn)檢測嗜肺巴斯德桿菌的方法為傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定以及血清學(xué)方法。因國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法費時費力、操作繁瑣，需要綜合上述幾種方法的檢測結(jié)果才能得出結(jié)論，且檢測周期比較長，不適用于對大規(guī)?；铙w實驗動物感染嗜肺巴斯德桿菌的實時快速監(jiān)測。

PCR 方法由于其操作簡便、敏感性高、特異性強且重復(fù)性好，已被廣泛應(yīng)用于實驗動物的微生物檢測。邢進等[6]對經(jīng)測序確認(rèn)的227 株嗜肺巴斯德桿菌菌株，用BD 自動生化鑒定的陽性率為53.6%，用Benga PCR 方法可檢出所有菌株，表明PCR 方法對病原菌的陽性檢出率較高。本文采用PCR 方法，通過摸索前期采樣及樣本的處理方法，建立快速、準(zhǔn)確、簡便和實時監(jiān)測嗜肺巴斯德桿菌的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗所用動物飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)實驗動物中心屏障設(shè)施[SYXK(滬)2018-0028]隔離檢疫區(qū)隔離包內(nèi)，包括經(jīng)第三方檢測機構(gòu)(蘇州西山生物技術(shù)有限公司)檢測確認(rèn)感染嗜肺巴斯德桿菌 Heyl型陽性[清潔級，C57BL/6，16 ♂13 ♀，6 周齡，18～20 g，共5 籠，SCXK(滬)2017-001]和嗜肺巴斯德桿菌Jawetz 型陽性[清潔級，C57BL/6，1 ♂2 ♀，9 周齡，25～30 g，共1 籠，SCXK(滬)2017-001]的待生物凈化的實驗小鼠，以及飼養(yǎng)于本設(shè)施SPF 屏障內(nèi)的哨兵鼠[SPF 級，ICR，116 ♀，17周齡，40～45 g，共58 籠， SCXK(京)2016-0006]。

1.2 菌株

嗜肺巴斯德桿菌Jawetz型和Heyl型標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA購自蘇州西山生物技術(shù)有限公司。嗜肺巴斯德桿菌Jawetz 型和Heyl 型菌株分離自實驗室購買的轉(zhuǎn)基因小鼠，并和Jawetz 型、Heyl 型的標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA 作比對，最終測序驗證。

1.3 主要試劑與儀器

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自杭州濱河微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、PCR 純化試劑盒和100 bp DNA Ladder 均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；糞便基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；2× ES Tag Master Mix(Dye)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；瓊脂糖和Sybr Safe 核酸染料購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司。

新加坡ESCO Class Ⅱ BSC 生物安全柜；德國Eppendorf Innova 40 恒溫?fù)u床；美國Thermo NanoDrop 2000 分光光度計；美國ABI Pro Flex PCR 儀；美國Bio-Rad Gel Doc XR+核酸電泳及凝膠成像系統(tǒng)；德國Eppendorf 高速冷凍離心機；上海一恒醫(yī)療器械有限公司LRH-150 生化培養(yǎng)箱。

1.4 實驗方法

本研究方案經(jīng)上海交通大學(xué)實驗動物倫理與使用委員會(IACUC)批準(zhǔn)，并獲取研究計劃編號(A2017012)。

1.4.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)嗜肺巴斯德桿菌Jawetz 型和Heyl 型基因序列的特異性區(qū)域，參照文獻(xiàn)[7]設(shè)計引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4.2 PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化 用嗜肺巴斯德桿菌Jawetz 型和Heyl 型標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA 分別摸索PCR 引物的特異性和靈敏度。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包括：2× ES Tag Master Mix(Dye) 10 μL，引物濃度分別為0.10 μmol/L、0.15 μmol/L、0.20 μmol/L、0.25 μmol/L 和0.30 μmol/L，DNA模板20 ng。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃ 30 s，共30 個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并切膠回收后測序驗證。

表1 引物序列Table 1 The primer sequences

1.4.3 PCR 靈敏度測試 將嗜肺巴斯德桿菌Jawetz型和Heyl 型基因組DNA 的模板終質(zhì)量濃度分別調(diào)整為100ng/μL、10-2ng/μL、10-4ng/μL、10-6ng/μL、10-8ng/μL、10-10ng/μL、10-11ng/μL、10-12ng/μL、10-13ng/μL 和10-14ng/μL，每個梯度各取1 μL 進行PCR 靈敏度測試。

1.4.4 實驗動物的不同采樣及處理方法 將嗜肺巴斯德桿菌Heyl 型感染陽性的實驗小鼠每籠取2 只，分別采集飲水、口腔、新鮮糞便和腸道內(nèi)容物樣本。2 只小鼠的樣本均勻混合后，分別用培養(yǎng)煮沸法和試劑盒方法提取各類樣本中的DNA，并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

培養(yǎng)煮沸法：各種采集樣本分別接種于5 mL普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液，其中飲水和口腔樣本接種量均為100 μL ，糞便和腸道內(nèi)容物樣本均用無菌槍頭沾取少許接種。所有接種樣本經(jīng)37 ℃，180 r/min 培養(yǎng)16～18 h，取1 mL 菌液經(jīng)4 ℃、8 000 r/min 離心3 min 后棄上清液，加入100 μL TE 緩沖液，100 ℃分別煮沸1 min、2 min、5 min 和10 min 后放冰上5 min，4 ℃、12 000 r/min離心5 min 后取上清液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 樣本的PCR 方法檢測 將實驗動物的檢測樣本通過不同采樣以及處理方法，獲取基因組DNA，然后用摸索好的PCR 條件進行PCR 擴增。

1.4.6 實驗動物樣本采集及處理方法的重復(fù)性實驗 將嗜肺巴斯德桿菌Jawetz 型感染陽性的1 籠實驗小鼠按照1.4.4 的方法處理后，通過PCR 擴增驗證嗜肺巴斯德桿菌Jawetz 型是否和Heyl 型的檢測效果一致。

1.4.7 在實驗動物檢測樣本中的應(yīng)用 采集本中心SPF屏障設(shè)施內(nèi)58籠(每籠2只)共116 只ICR哨兵鼠的口腔樣本，用培養(yǎng)煮沸1 min 的方法提取樣本DNA，分別進行嗜肺巴斯德桿菌Jawetz 型和Heyl 型PCR 擴增。另外將15 籠(每籠抽檢1 只)哨兵鼠送第三方檢測機構(gòu)按照SPF 級實驗小鼠國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢測項目進行全項檢測。

2 結(jié)果

2.1 PCR 引物濃度的優(yōu)化

PCR 結(jié)果顯示，嗜肺巴斯德桿菌Jawetz 型和Heyl型菌株DNA在引物濃度0.15～0.30 μmol/L的擴增條件下擴增效果較好(圖1)。

2.2 PCR 退火溫度的優(yōu)化

PCR 結(jié)果顯示，嗜肺巴斯德桿菌Jawetz 型和Heyl 型菌株DNA 在退火溫度56～60 ℃的擴增條件下擴增效果較好(圖2)。

2.3 PCR 靈敏度

PCR 結(jié)果顯示，嗜肺巴斯德桿菌 Jawetz 型和Heyl型的DNA模板最低檢出量均為10～13 ng，靈敏度較高(圖3)。

2.4 實驗動物的不同采樣方法比較

PCR 結(jié)果顯示，飲水和糞便樣本中各只有2 個樣本擴出目的基因，且擴增的目的條帶較弱；口腔和腸道內(nèi)容物的5 個樣本均能擴出目的基因，擴增效果較好(圖4)。

圖1 PCR引物濃度的優(yōu)化Figure 1 Optimization of PCR primer concentration

圖2 PCR退火溫度的優(yōu)化Figure 2 Optimization of PCR annealing temperature

圖3 PCR靈敏度實驗Figure 3 Sensitivity of the PCR assay

圖4 不同采樣方法的比較Figure 4 Comparison of different sampling methods

2.5 不同煮沸時間處理DNA 方法的比較

PCR 結(jié)果顯示，5 籠實驗小鼠的口腔樣本用培養(yǎng)煮沸法分別煮沸1 min、2 min、5 min 和10 min后均能擴出目的基因，且擴增效果較好(圖5)。

圖5 不同煮沸時間提取DNA 的比較Figure 5 Comparison of different boiling time for DNA extraction

2.6 樣本采集及處理方法的重復(fù)性實驗

PCR 結(jié)果顯示， Jawetz 型感染陽性小鼠的飲水樣本用兩種處理方式均未擴增出目的基因(圖6A)；糞便樣本用3 種方法處理，有兩種能擴增出目的基因(圖6B)；口腔樣本用兩種方法均能擴出目的基因，且擴增效果較好(圖6C)。

2.7 檢測樣本中的應(yīng)用

所有檢測小鼠的PCR結(jié)果和送檢的結(jié)果均為陰性，檢測結(jié)果一致。

3 討論

圖6 不同采樣及處理方法的重復(fù)性實驗Figure 6 Repeated experiments of different sampling and processing methods

嗜肺巴斯德桿菌是目前嚙齒類實驗動物感染率最高的病原菌之一，主要感染實驗動物的咽、氣管、肺、子宮、眼部以及腸道等器官[8]。國家標(biāo)準(zhǔn)實驗室檢測該菌的傳統(tǒng)方法是，一般采集實驗動物的呼吸道分泌物、病灶組織、膿汁或者腸道內(nèi)容物，在血瓊脂平皿上劃線培養(yǎng)后進行后續(xù)分離純化和生化鑒定。當(dāng)遇到菌落形態(tài)等表型特征與嗜肺巴斯德桿菌接近的菌株時，容易混淆，造成假陽性結(jié)果[6]。另外，由于國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法與檢測試劑、檢測程序、硬件條件以及檢測人員的業(yè)務(wù)水平和主觀判斷均有密切關(guān)系[9]，因此該方法存在一定的局限性，需要借助一些其他手段，如PCR 和基因測序等[10]。

本研究用PCR方法對嗜肺巴斯德桿菌Heyl型和Jawetz 型兩對引物的特異性進行了驗證，并通過靈敏度測試實驗測出兩對引物的最低模板DNA的檢出量均為10～13 ng，能夠高效檢出嗜肺巴斯德桿菌感染的低菌量實驗動物樣本。通過比較實驗小鼠飲水、口腔、糞便以及腸道內(nèi)容物等4種采樣方法以及培養(yǎng)煮沸法和試劑盒法兩種不同的樣本DNA提取方法，對傳統(tǒng)的樣品采集和處理方式均進行了優(yōu)化和改進。最終通過培養(yǎng)煮沸1 min的方法快速提取實驗動物口腔樣本中的細(xì)菌基因組DNA 作為PCR 模板，可有效檢出嗜肺巴斯德桿菌的兩種基因型。

本研究方法具有快速簡便、靈敏、特異、穩(wěn)定性高和成本低等優(yōu)點，且對動物不會造成任何傷害，能夠為高校和研究機構(gòu)等實驗動物使用單位在大規(guī)模實驗動物日常監(jiān)測、感染早期診斷、生物凈化和隔離檢疫時快速檢測嗜肺巴斯德桿菌提供借鑒。