張雅雯, 朱光旭, 李雅喆, 李 昊, 王紹曄, 張皓云, 王鳳斌

(1. 濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 濰坊 261053; 2. 濰坊醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院, 濰坊 261053;3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/動物醫(yī)學(xué)院, 武漢430070;4. 濰坊醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 濰坊261053)

大段骨缺損是臨床骨科的一大難題，研發(fā)理想的骨科材料對于骨缺損的修復(fù)有著廣闊的發(fā)展前景。大鼠顱骨缺損模型具有可重復(fù)性強(qiáng)、適宜于多種不同類型骨科材料的應(yīng)用評估等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于骨組織工程實驗研究[1-2]。臨界骨缺損(critical size defects, CSD)是指在特定骨和動物中，活體動物不會自發(fā)愈合的最小骨缺損[3]。雙側(cè)直徑5 mm 的骨缺損是最典型的大鼠顱骨CSD。與體內(nèi)其他骨相比，顱骨中血液供應(yīng)及骨再生能力均較差，因此，顱骨CSD 動物模型是評價骨科材料體內(nèi)骨修復(fù)性能的理想模型[4]，但在構(gòu)建模型過程中出血、硬腦膜和腦組織損傷等并發(fā)癥會影響骨科植入材料在體內(nèi)的骨修復(fù)過程，甚至導(dǎo)致動物死亡率增加。本研究改良了動物模型制備方法，以期建立損傷小、成功率高、能有效評價骨科材料性能的大鼠顱骨缺損模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級12 周齡雄性SD 大鼠40 只，購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司[SCXK(魯)2019-0003]，體質(zhì)量300~350 g，隨機(jī)分為對照組16 只和實驗組24 只。大鼠飼養(yǎng)于濰坊醫(yī)學(xué)院動物實驗中心[SYXK(魯)2019-0016]。本課題所有實驗步驟均經(jīng)濰坊醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會核準(zhǔn)(準(zhǔn)字號:2019SDL033)。

1.2 主要儀器與試劑

小動物骨鉆(南京卡爾文生物科技有限公司，KW-LGZ)，配套空心環(huán)鉆頭(外徑5 mm，內(nèi)徑4 mm)，實心磨鉆頭(直徑1 mm)；水合氯醛(北京西濃科技有限公司)；氧化鋁生物陶瓷(直徑5 mm，厚度2 mm)，由北京中材高新材料股份有限公司提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 對照組大鼠顱骨缺損模型構(gòu)建 將對照組16 只大鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛(3.0~3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺上。對照組大鼠常規(guī)手術(shù)[5]，只用空心環(huán)鉆頭垂直于顱骨表面用力，在矢狀縫左右兩側(cè)的頂骨各鉆取直徑5 mm 的圓形全層骨缺損。從骨缺損處分別植入氧化鋁生物陶瓷，逐層縫合。術(shù)后動物側(cè)臥位，注意保溫，連續(xù)3 d 每日每只肌肉注射青霉素(20 萬單位)以防止感染。

1.3.2 實驗組大鼠顱骨缺損模型構(gòu)建

1.3.2.1 暴露顱骨 將實驗組24 只大鼠從鼻骨開始，沿頭頂部正中線縱行皮膚切口1.5~2.0 cm，用手術(shù)刀柄輕輕分離皮下組織。然后沿顱骨矢狀縫整齊切開骨膜，手術(shù)刀柄仔細(xì)剝離骨膜下組織，充分暴露雙側(cè)頂骨、枕骨和部分額骨。

1.3.2.2 顱骨鉆孔及材料植入 手術(shù)中用無菌生理鹽水滴注降溫(1~2 滴/s)，于大鼠顱骨頂中線兩側(cè)各鉆取一個直徑為5 mm 的圓形全層骨缺損。開始先用空心環(huán)鉆頭低速(1 400~1 500 r/min)垂直方向鉆取顱骨，避免轉(zhuǎn)速過快不易控制而導(dǎo)致鉆頭傷及硬腦膜。開始時可稍微附加外力，以增加顱骨鉆取速度并縮短手術(shù)時間。接近顱骨鉆穿時需動作輕柔，鉆頭由垂直位分別向前、后、左、右四個方向傾斜20°~30°，不再附加外力，單純憑借電鉆的自然重力使大部分顱骨間斷鉆穿(圖1A)，保留少部分顱骨的連接。然后用眼科鑷子測試顱骨有松動后，沿著周邊圓形缺損將顱骨去除(圖1B)。再用實心磨鉆頭仔細(xì)打磨骨缺損周邊少量殘留骨組織(圖1C)。植入氧化鋁生物陶瓷(圖1D)，然后逐層縫合。

圖1 改良大鼠顱骨缺損模型構(gòu)建手術(shù)過程Figure 1 The construction process of modified rat skull defect model

1.3.3 觀測指標(biāo) 觀測和比較對照組和實驗組手術(shù)中顱骨鉆孔 (每只大鼠鉆2 個孔) 時間，以及出血(≥0.1 mL)、硬腦膜損傷(腦組織暴露)和腦組織損傷(鉆頭觸及腦組織)等并發(fā)癥發(fā)生情況；手術(shù)后1 周觀察大鼠切口有無紅腫和滲出；手術(shù)后8 周，麻醉動物，沿著原來手術(shù)切口暴露顱骨缺損部位，大體觀察氧化鋁生物陶瓷有無松動或者移位。在構(gòu)建模型手術(shù)中無硬腦膜和腦組織損傷，術(shù)后材料無移位，即確定造模成功。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用表示，組間差異比較采用t 檢驗和χ2檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 顱骨鉆孔時間

實驗組每只大鼠顱骨鉆2個孔的時間為 (6.00 ±2.47)min，與對照組的(9.25±3.49)min 比較，時間明顯縮短(P<0.01)。

2.2 手術(shù)中和手術(shù)后觀察指標(biāo)

實驗組手術(shù)中的出血、硬腦膜損傷和腦組織損傷等并發(fā)癥發(fā)生率較對照組明顯減少(P<0.05)。實驗組手術(shù)后7 d，大鼠傷口愈合情況良好，無皮下滲出和腫脹；手術(shù)后8 周骨科材料固定位置良好，無移位和松動，與周圍骨組織連接緊密。實驗組造模成功率為95%(23/24)，明顯高于對照組的62%(10/16)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

3 討論

由創(chuàng)傷及疾病所導(dǎo)致的骨缺損是目前臨床較難解決的問題之一，而骨缺損修復(fù)已成為人們研究的一個熱點。組織工程技術(shù)為治療骨缺損提供了新的研究方向和思路[6-7]，不同的骨修復(fù)材料首先需要進(jìn)行動物實驗體內(nèi)評估與檢測才能應(yīng)用于臨床。大鼠具有容易飼養(yǎng)、生長較快、對傳染病的抵抗力較強(qiáng)等優(yōu)點，通常選擇成年雄性大鼠進(jìn)行實驗，以避免大鼠本身的激素水平和年齡對骨缺損組織修復(fù)能力的影響。Bosch 等[8]認(rèn)為，大鼠顱骨缺損直徑為5 mm 時，除了在缺損邊緣處有少量的骨形成之外，直到術(shù)后12 個月都不能完成骨性修復(fù)。在顱骨矢狀縫的左右兩側(cè)建立CSD 可以避免損傷矢狀竇，此大鼠顱骨缺損模型應(yīng)用比較廣泛。然而在傳統(tǒng)的顱骨鉆取過程中很容易出現(xiàn)硬腦膜、腦組織損傷及出血等并發(fā)癥，影響骨修復(fù)過程。

表1 兩組大鼠手術(shù)中、手術(shù)后出現(xiàn)并發(fā)癥及造模成功情況Table 1 Comparison of complications during and after surgery and successful modeling between the two groups of rats (例)

生物陶瓷材料結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，分子中的鍵合力較強(qiáng)，而且都具有較高的強(qiáng)度、耐磨性及化學(xué)穩(wěn)定性等特點，因此被廣泛應(yīng)用于組織工程和生物醫(yī)學(xué)研究[9]。氧化鋁是目前臨床常用的生物陶瓷材料[10]，具有化學(xué)性能穩(wěn)定、耐磨損、耐腐蝕和良好的生物學(xué)相容性等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于人工關(guān)節(jié)、整形外科和牙科等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[11]。本實驗將氧化鋁生物陶瓷材料植入骨缺損處，評估傳統(tǒng)與改良大鼠顱骨缺損模型制備方法對骨修復(fù)作用的影響。

本實驗?zāi)Ｐ偷母牧缄P(guān)鍵在于：①手術(shù)中采用2 種鉆頭，空心環(huán)鉆頭用于鉆取顱骨，實心磨鉆頭用于打磨骨缺損周邊少量殘留骨組織，改變了一種鉆頭直接鉆穿顱骨后容易損傷硬腦膜和腦組織的情況，縮短了手術(shù)時間，同時保證顱骨缺損尺寸與植入材料相匹配。②用手術(shù)刀片整齊切開骨膜，一方面利于術(shù)后縫合，縫合好的骨膜和顱骨下的完整硬腦膜能較好固定植入的生物材料，另一方面能充分發(fā)揮骨膜和硬腦膜在骨組織修復(fù)過程中的骨誘導(dǎo)和促進(jìn)新骨形成的作用。③手術(shù)中，當(dāng)顱骨接近鉆穿時，不再施加外力，而且將空心鉆頭傾斜20°~30°，首先使骨缺損邊緣大部分顱骨間斷被鉆穿，但還保留少部分顱骨的連接，避免顱骨組織同時完全被鉆穿后鉆頭直接觸及顱骨下組織而導(dǎo)致?lián)p傷和出血。④避免損傷后血液中間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞因子等進(jìn)入骨缺損處干擾實驗結(jié)果，而且同一大鼠顱頂骨兩側(cè)分別制作的5 mm CSD 可用于自身對照研究，減少其他干擾因素對于骨缺損修復(fù)的影響。

骨缺損動物模型的建立對于骨組織工程研究有重要意義。改良的大鼠顱骨缺損模型建立時較好保護(hù)了骨膜、硬腦膜和腦組織，尤其是對經(jīng)驗不足的初學(xué)者，明顯降低手術(shù)中并發(fā)癥的發(fā)生，大大提高造模成功率，該模型具有高度的可重復(fù)性，更安全有效，可應(yīng)用于不同類型骨修復(fù)材料的評估與檢測。