李晨晨 肖芝松（通訊作者）

（大理大學(xué) 云南 大理 671000）

細(xì)胞自噬是指在內(nèi)源性自噬相關(guān)基因(autophagy related gene，Atg)的嚴(yán)格調(diào)控下的細(xì)胞自我代謝過程也是人體防止正常細(xì)胞損傷的機(jī)制，若自噬機(jī)制異常就會引起細(xì)胞損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤早期，自噬能夠保護(hù)腫瘤細(xì)胞躲避自體免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活；而過度的自噬又會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤機(jī)制[1]。

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，全球范圍內(nèi)每年新增的膀胱癌患者超過33 萬例，死亡病例多于3 萬例[2]。在我國泌尿生殖系腫瘤中，膀胱癌也是發(fā)病率和病死率最高的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，而且中國膀胱癌的發(fā)病率也在呈逐年增長的趨勢[3]。若能進(jìn)一步明確膀胱癌的獨(dú)立預(yù)后因子，對患者的診斷、治療方式和改善患者生活質(zhì)量、總體生存率都會起到至關(guān)重要的作用。

1.資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料的選取

下載癌癥基因組圖譜(The CancerGenome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫中人膀胱癌的RNA-Seq 數(shù)據(jù)和412 例膀胱癌患者臨床信息。RNA-Seq 數(shù)據(jù)中包括19 例正常膀胱樣本和414 例膀胱癌樣本的測序數(shù)據(jù)。通過R 軟件對所下載數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。通過HADB(http：//www.autophagy.lu/)獲得人自噬相關(guān)mRNAs數(shù)據(jù)。

1.2 差異基因的篩選

整理TCGA 數(shù)據(jù)庫膀胱癌RNAs 表達(dá)情況并從其中提取人自噬相關(guān)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，通過R 軟件對膀胱癌正常樣本和癌癥樣本進(jìn)行分析(用limma 包對自噬基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理并采用wilcox.t 檢驗(yàn)進(jìn)行差異表達(dá))。采用錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)對自噬mRNAs 的As 的差異表達(dá)的顯著性進(jìn)行校正（標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為：①P及FDR ＜0.05；②∣logFCfilter (FC)∣＞1）。共篩選出38 個顯著差異表達(dá)自噬基因。

1.3 單因素和多因素cox 回歸分析

通過排除2 例生存信息不完整和4 例RNA 測序數(shù)據(jù)缺失的膀胱癌患者資料，將406 例患者的對應(yīng)的自噬基因測序數(shù)據(jù)和生存數(shù)據(jù)進(jìn)行合并。利用R 語言survival 程序包進(jìn)行單因素cox分析，并把得到的與膀胱癌預(yù)后顯著相關(guān)的自噬基因（P＜0.05）納入多因素cox 分析來進(jìn)一步驗(yàn)證這些基因?qū)Π螂装┗颊哳A(yù)后的價值。經(jīng)過上述分析，建立評估膀胱癌患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型 風(fēng)險(xiǎn)值(R iskScore)=expmRNA1×βmRNA1+expmRNA2×βmRNA2+ …… +expmRNAn×βmRNAn(exp：為表達(dá)水平；β 為多因素cox 回歸分析的回歸系數(shù))。

1.4 劃分高低風(fēng)險(xiǎn)組膀胱癌患者并繪制ROC 曲線

通過構(gòu)建的膀胱癌患者預(yù)后cox 模型來計(jì)算406 個膀胱癌患者的風(fēng)險(xiǎn)值。以中位值將患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)兩組并進(jìn)行Kaplan-Meier 生存曲線繪制。使用R 軟件survival、survminer包來繪制ROC 曲線來判斷預(yù)后模型預(yù)測患者五年生存率的準(zhǔn)確概率。

2.結(jié)果

2.1 差異自噬基因的篩選

通過R 軟件整理TCGA 數(shù)據(jù)庫中433 個樣本（正常樣本19 例、腫瘤樣本414 例）的基因測序數(shù)據(jù)并提取其中232 個自噬基因（通過HADB(http：//www.autophagy.lu/)獲得）的表達(dá)數(shù)據(jù)，通過R 軟件利用wilcox.t 檢驗(yàn)進(jìn)行差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)232 個基因中有38 個自噬基因顯著差異表達(dá)。

2.2 單因素和多因素cox 回歸分析

為了初步篩選與膀胱癌預(yù)后相關(guān)的自噬基因，首先通過R軟件的“survival 程序包”對差異表達(dá)的38 個自噬mRNAs 進(jìn)行單因素Cox 回歸分析，P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果一共發(fā)現(xiàn)有7 個自噬基因與患者預(yù)后顯著相關(guān)（P＜0.05），通過R 軟件繪制差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的森林圖（圖1）進(jìn)行展示。接下來通過多因素cox 分析進(jìn)行進(jìn)一步篩選，發(fā)現(xiàn)5 個自噬基因APOL1、ITGA3、P4HB、MYC、DIRAS3 具有預(yù)測患者預(yù)后的功能，預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型為：風(fēng)險(xiǎn)值=（APOL1×-0.14398468）+（ITGA3×-0.10405556）+（P4HB×0.68837742）+（MYC×0.20125767）+（DIRAS3×0.32094798）。其中APOL1 和ITGA3 自噬基因的多因素cox 回歸系數(shù)均小于0，提示這2 個自噬基因高表達(dá)患者的預(yù)后較低表達(dá)的患者較好。P4HB、MYC、DIRAS3 自噬 基因的多因素cox 回歸系數(shù)均大于0，提示這3 個自噬基因低表達(dá)患者的預(yù)后會優(yōu)于高表達(dá)的患者。

圖表 1

2.3 膀胱癌患者高低風(fēng)險(xiǎn)組的劃分及ROC 曲線的繪制

為了評估預(yù)后模型的預(yù)測能力，首先對高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組進(jìn)行K-M 生存分析，通過風(fēng)險(xiǎn)預(yù)后模型來計(jì)算406 例患者的風(fēng)險(xiǎn)值并以中位值將患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)兩組。K-M 生存曲線（圖2）顯示高風(fēng)險(xiǎn)組（五年生存率約為32.2%）和低風(fēng)險(xiǎn)組（五年生存率55.5%）患者生存率之間存在顯著差異（P＜0.001）。ROC 曲線（圖3）下面積為0.757，確認(rèn)了模型預(yù)測膀胱癌患者預(yù)后的準(zhǔn)確性。

圖表 3

3.討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一。目前膀胱癌的診斷金標(biāo)準(zhǔn)為：膀胱鏡下膀胱黏膜活檢和尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查，由于這些方法被各自的局限性所限制，所以尋找一種早期無創(chuàng)性的診斷方式就極為重要。

自噬在腫瘤發(fā)生的初始階段主要起抑制腫瘤發(fā)生的作用，在晚期則主要促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[4]。本文對膀胱癌中異常表達(dá)的自噬基因進(jìn)行探索，篩選出與患者總體生存預(yù)后顯著相關(guān)的核心自噬基因，從基因表達(dá)層面預(yù)測膀胱癌患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。我們篩選出38 個自噬相關(guān)mRNAs 并對這些自噬mRNAs進(jìn)行單因素cox 回歸分析，篩選出與膀胱癌患者預(yù)后顯著相關(guān)的自噬7 個mRNAs 之后，對這7 個基因進(jìn)行多因素cox回歸分析,最終選出5 個膀胱癌的獨(dú)立預(yù)后因子：APOL1、ITGA3、P4HB、MYC、DIRAS3?；谶@5 個自噬mRNAs 來構(gòu)建預(yù)后模型。預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型為：風(fēng)險(xiǎn)值=（APOL1×-0.14398468）+（ITGA3×-0.10405556）+（P4HB×0.68837742）+（MYC×0.20125767）+（DIRA S3×0.32094798）。其 中APOL1 和ITGA3 的多因素cox 回歸系數(shù)均小于0，提示這2個自噬基因高表達(dá)患者的預(yù)后優(yōu)于低表達(dá)的患者，P4H B、MYC、DIRAS3 的多因素cox 回歸系數(shù)均大于0，提示這3 個自噬基因低表達(dá)患者的預(yù)后優(yōu)于高表達(dá)的患者。利用模型對406 例膀胱癌患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)值的評分并根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)值中位值將患者劃分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組，Kaplan-Meier 生存分析證明高風(fēng)險(xiǎn)組膀胱癌患者的總體生存率顯著低于低風(fēng)險(xiǎn)組患者（P＜0.001）。ROC 曲線驗(yàn)證了模型判斷膀胱癌患者風(fēng)險(xiǎn)值的可靠性。通過預(yù)測膀胱癌患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)值，可以為膀胱癌患者進(jìn)行個性化治療提供參考，從而降低患者病死率，改善患者預(yù)后。

本研究的不足之處在于所有數(shù)據(jù)均來TCGA 數(shù)據(jù)庫提供的膀胱癌mR NAs 測序數(shù)據(jù)，無法完全代表其蛋白水平表達(dá)的情況。后續(xù)可以通過選取臨床樣本來驗(yàn)證這個5 個自噬基因在預(yù)測患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)方面的價值。

綜上，本研究通過對膀胱癌患者的基因表達(dá)譜及其臨床信息進(jìn)行綜合分析，發(fā)現(xiàn)了5 個最有可能具有預(yù)測患者生存預(yù)后功能的獨(dú)立因素并構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型，對膀胱癌患者的診斷和治療和改善預(yù)后提供了參考依據(jù)。