楊慧潔 虞莉莎 殷雪瑞 陳占國 鄭曉群

世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計結果表明，每年新發(fā)丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染病例約300萬～400萬，感染率約3%[1]。大多數(shù)情況下，丙型肝炎已被證實無臨床表現(xiàn)，但延誤診斷可能導致肝細胞癌和肝硬化的晚期發(fā)作[2]。因此，HCV感染的防治形勢仍然非常嚴峻。HCV是一種具有高度遺傳多樣性的正股單鏈RNA病毒，HCV 基因分型有助于了解丙肝的危險因素以及肝臟疾病的進展情況[3]。因此，不同基因型的HCV感染患者在臨床抗病毒用藥方面需差異性對待[4, 5]。本研究采用反轉錄實時熒光定量PCR(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)一步法對慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)患者進行基因分型，探討CHC患者HCV基因分型與肝功能指標和HCV RNA拷貝數(shù)的關系，為CHC患者臨床判斷CHC病情提供實驗室依據。

對象與方法

1.研究對象：回顧性分析2018年1月～2019年7月在筆者醫(yī)院門診或住院接受HCV基因分型的CHC患者94例作為研究對象，其中男性64例，女性30例，患者年齡23～73歲，中位年齡43歲。納入標準：①符合CHC的診斷標準[6]；②在HCV基因分型前未接受過抗病毒治療；③無合并其他感染、腫瘤、炎癥等疾病，臨床資料完整。排除標準：①已接受或正在接受抗病毒治療；②合并其他感染，如乙肝等；③急性丙型肝炎病毒感染。本研究已獲筆者醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

2.主要儀器和試劑：ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)、西門子ADVIA2400全自動生化分析儀(德國Siemens公司)、Anadas9850全自動核酸提純系統(tǒng)(廈門安普利生物工程有限公司)。丙型肝炎基因分型試劑盒(泰普生物科學有限公司，批號311902)，HCV RNA定量試劑盒(廈門安普利生物工程有限公司，批號201901002)、丙氨酸轉移酶試劑盒(德國Siemens公司，批號 R1試劑 217AL，R2試劑 218AL)，天門冬氨酸氨基轉移酶(德國Siemens公司，批號 R1試劑 218AS，R2試劑 219AS)、總膽紅素(德國Siemens公司，批號 R1試劑 433BR，R2試劑 435BR)、直接膽紅素(德國Siemens公司，批號 R1試劑 425BR，R2試劑 427BR)。

3.標本處理：采用EDTA抗凝真空管采集受檢者靜脈血2ml，充分混勻，3500r/min離心5min，留取上層血漿，并轉移至紫外消毒的無菌管中，置-80℃冰箱內待檢。

4.HCV RNA定量檢測：采用廈門安普利生物工程有限公司的HCV RNA定量試劑盒進行HCV RNA定量檢測，即采用配套的Anadas9850全自動核酸提純系統(tǒng)進行HCV核酸提取，最后在美國ABI公司的ABI 7500熒光定量PCR進行PCR擴增。檢測過程嚴格按照儀器及試劑標準操作規(guī)程(SOP)進行。

5.肝功能相關指標檢測：采用德國Siemens公司ADVIA2400全自動生化分析儀及配套丙氨酸轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、總膽紅素(TIBL)、直接膽紅素(DIBL)測定試劑盒檢測。

6.HCV基因分型檢測：本實驗室已做好RT-qPCR一步法檢測HCV基因分型試劑盒的性能驗證，在此基礎上接受HCV基因分型的標本檢測。采用核酸提取柱法對待測標本進行RNA抽提，采用泰普生物科學有限公司的丙型肝炎基因分型試劑盒進行檢測，該試劑盒需同時配制HCV 1b RT-PCR 反應液、HCV 2a/6a RT-PCR 反應液和HCV 3a/3b RT-PCR 反應液，各反應管的熒光素標記，HCV 1b、HCV 2a和HCV 3a用FAM熒光素標記，HCV 6a和HCV 3b用JOE熒光素標記。在50μl反應體系中每管加試劑40μl和10μl模板。在ABI 7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上完成PCR擴增，熒光通道檢測分別為FAM-MGB和JOE-MGB。

7.質量控制及結果判斷：標本檢測過程需同時測定陰性質控和陽性質控，只有兩者在控時進行結果判讀。待測樣本結果判讀，詳見表1。以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則本次實驗無效，需重新進行。

8.統(tǒng)計學方法：應用 SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計分析。非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)(范圍)表示，計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示。計量資料，非正態(tài)分布采用多組獨立秩和檢驗；HCV RNA 的對數(shù)與肝功能指標分析采用Spearman秩相關法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。5種基因型的TIBL和DIBL用中位數(shù)表示并用GraphPad 5.0做圖進行比較。

表1 HCV基因分型反應管熒光素標記及結果判讀

*表示HCV RNA，單位為拷貝數(shù)/微升

結 果

1.CHC患者的HCV基因型檢測結果：對94例CHC患者標本進行檢測，共檢出5種基因型及其他型別， HCV 1b型、2a型、3a型、3b型、6a型和其他型別的RT-qPCR擴增曲線。有陽性擴增曲線的標本90例，HCV基因分型檢出率為95.7%，其中1b型30例(31.9%)，2a型6例(6.4%)，3a型12例(12.8%)，3b 型22例(23.4%)，6a型20例(21.2%)，其他型別4例(4.3%)。基因型分布以1b型、3b型和6a型為主，其中1b型占比最高(圖1)。

圖1 HCV基因型的擴增曲線A～F分別代表HCV 1b型、2a型、3a型、3b型、6a型和其他型別，縱坐標ΔRn表示熒光值，橫坐標Cycle表示循環(huán)數(shù)

2.CHC患者的HCV基因型與血ALT和AST關系：在HCV基因分型有陽性擴增曲線的90例CHC患者中，比較不同HCV基因型之間ALT和AST水平。在5種HCV基因型中，HCV 3b型的ALT和AST水平高于其他4種基因型，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003，P=0.006，表2)。

表2 不同HCV基因型之間ALT、AST水平和HCV RNA拷貝數(shù)比較[M(范圍)]

3.CHC患者的HCV基因型與HCV RNA拷貝數(shù)的關系：在90例有陽性擴增曲線CHC患者的HCV RNA檢測結果中，6a型HCV RNA拷貝數(shù)最高，3a型HCV RNA拷貝數(shù)最低。HCV基因型與HCV RNA拷貝數(shù)存在相關性，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.041，表2)。

4.CHC患者HCV 基因型與TIBL和DIBL水平的相關性：不同HCV基因型之間的TIBL和DIBL水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.364，圖2A；P=0.564，圖2B)。

討 論

圖2 不同HCV基因型之間的TIBL和DIBL水平比較A.TIBL;B.DIBL

HCV易導致患者肝臟慢性纖維化甚至演變?yōu)楦伟?，繼發(fā)于HCV感染所致的慢性嚴重肝病和死亡人數(shù)仍在持續(xù)增長[7]。因此CHC患者及時和正確的抗病毒治療對于防止疾病進展、改善預后至關重要[8]。傳統(tǒng)觀念認為,抗HCV和HCV RNA拷貝數(shù)是診斷HCV感染的主要指標，抗HCV可提示HCV的現(xiàn)癥感染和既往感染，HCV RNA拷貝數(shù)則是診斷HCV病毒復制活躍程度的指標[9]。然而，HCV RNA基因分型結果有助于判定 HCV 治療的難易程度及制定抗病毒治療的個體化方案，不同基因型的HCV所針對的治療藥物并不相同[10～12]。基因測序被認為是目前 HCV分型的金標準，但其操作繁瑣、程序復雜、成本過高，難以對較大樣本進行分析，因此在臨床工作中不可行。本研究采用核酸提取柱結合RT-qPCR一步法檢測CHC患者的基因型，該方法具有快速、重復性好、操作簡便和特異性高等優(yōu)點。采用該方法對筆者醫(yī)院94例已確診的CHC患者進行HCV基因分型檢測，共檢測出5種基因型，檢出基因型別的有90例，陽性檢出率為95.7%，該方法可作為輔助診斷技術用于確診HCV感染。

國外研究證實HCV基因型1是全球最流行的，占所有HCV病例的46.2%，基因型3在全球排名第2位，約占30.1%[13]。在亞洲及我國大部分地區(qū)流行的 HCV 型別為1b，其次為2a，但近幾年在各種因素影響下，原有基因型分布狀況正迅速發(fā)生改變[9, 14]。本研究中HCV基因型分布以1b型為主，占31.9%，其次為3b型和6a型，占23.4%和21.2%。3b型和6a型正逐漸增長，成為HCV基因型分布的主要型別，這與我國南方地區(qū)HCV基因型的分布一致[15]。

不同HCV基因型在肝功能指標上也存在差異，本研究發(fā)現(xiàn)3b型的ALT和AST水平均高于其他基因型(P<0.05)，CHC患者不同基因型之間的TIBL和DIBL水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。然而有研究者報道1b 基因型患者 ALT、AST水平均高于 2a 基因型患者及其他基因型，這與本研究結果并不一致，其原因可能是HCV基因型與肝功能指標相關性存在地區(qū)差異[16]。ALT和AST可以反映肝臟炎性程度，不同基因型患者的肝臟損害程度可能不同，3b型的肝損較其他基因型要嚴重。本研究同時發(fā)現(xiàn)HCV基因型與HCV RNA拷貝數(shù)存在相關性，6a型HCV RNA拷貝數(shù)高于其他基因型(P<0.05)，說明6a型患者體內HCV含量較其他基因型高，這與Chen等[14]的研究結果一致。另外， 本研究CHC患者HCV RNA拷貝數(shù)與ALT、AST、TIBL和DIBL水平無明顯相關，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，該結果與謝月娜等[17]的報道一致。

本研究所采用的核酸提取柱結合RT-qPCR一步法對筆者醫(yī)院CHC患者的HCV基因型并未做到完全確定型別，仍然存在少數(shù)CHC患者在HCV RNA為陽性的情況下，不在所檢測的5種基因型范圍內，該結果說明了有少數(shù)基因型落在HCV 1b型、2a型、3a型，3b型和6a型之外，即HCV RNA>1000拷貝數(shù)/微升但HCV基因分型低于檢測限。因此，臨床在進行HCV基因分型檢測的同時需同時進行HCV RNA定量檢測，以提高其他型別的檢出，降低疑難結果報告率。另外，本研究也存在一些不足之處，如研究對象人數(shù)較少，筆者將在后續(xù)研究中進一步增加病例數(shù)。

綜上所述，本研究表明HCV基因型與慢性丙型肝炎患者肝臟功能指標和HCV RNA拷貝數(shù)存在相關性。應用核酸提取柱結合RT-qPCR一步法可以方便快速地檢測HCV基因型，為臨床判斷CHC病情提供實驗室依據。