周 碧 王文鵬 周 敏 李 宣 高吉照

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoplastic leukemia，ALL)是兒童時期最常見腫瘤性疾病，占15歲以下腫瘤患者總數(shù)的25%，近20年來發(fā)生率不斷增加，其發(fā)病可能與免疫、感染、輻射和遺傳等因素相關(guān)，具體機制尚不明確[1，2]。目前臨床以長程化學藥物治療為主，病程中不可避免合并臟器損傷、血流感染等，且部分患兒化療后不緩解、緩解后或骨髓移植后或嵌合抗原受體T細胞免疫治療后復發(fā)，問題的解決需要新型治療方案。Wnt通路尤其是Wnt/β-catenin信號通路與多種腫瘤的發(fā)生、進展關(guān)系密切[3]。筆者前期已對通路因子β-catenin、Wif-1和DVL的表達進行研究，證明Wnt/β-catenin通路參與了兒童ALL的發(fā)生[4～6]。本研究通過分析骨髓單核細胞中Fz4和sFRP1的表達，進一步探索Wnt通路與兒童ALL的關(guān)系，尋求新的治療靶點。

資料與方法

1.研究資料:留取徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院兒科血液與腫瘤病區(qū)與徐州醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院血液與腫瘤科就診的免疫性血小板減少(immune thrombocytopenia，ITP)患兒和ALL患兒骨髓，ITP診斷依據(jù)《兒童原發(fā)性免疫性血小板減少癥診療建議》[7]，ALL患兒入組條件：①骨髓細胞形態(tài)學初診ALL；②依據(jù)《兒童急性淋巴細胞白血病診療建議(第四次修訂)》[8]評估及治療且第33天骨髓達完全緩解；③確診前未使用激素及其他免疫抑制劑；④排除其他惡性疾病。實驗設計及操作流程獲徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準及患兒監(jiān)護人書面知情同意。

2.實驗分組：隨機選取符合條件ALL患兒50例，分別留取治療前及治療后第33天患兒骨髓作為初發(fā)組和緩解組，收集20例ITP患兒骨髓作為對照組。將初發(fā)組50例ALL患兒按危險度分為高危(high risk，HR)組、中危(intermediate risk，IR)組和低危(low risk，LR)組。

3.主要試劑與設備：TRIzol(美國Invitrogen公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒(日本TaKaRa公司)，rabbit anti-GAPDH(中國江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)，羊抗兔IgG-HRP，兔抗-SFRP1(英國Abcam公司)，兔抗-Frizzled 4(中國博奧森生物科技有限公司)，Western blot法檢測試劑盒(KGP1201，中國凱基生物技術(shù)股份有限公司)，One Step TB GreenTMPrimeScriptTMreal-time PCR Kit Ⅱ (SYBR Green，日本TaKaRa公司)，熒光定量PCR循環(huán)儀(美國ABI公司)，Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國 Bio-Rad公司)，凝膠成像系統(tǒng)(G:BOXChemiXR5,英國 Syngeni公司)。

4.留取患兒骨髓2.5ml，肝素抗凝，密度梯度離心法分離單個核細胞，-80℃冰箱凍存待用。

5.Real-time PCR法檢測骨髓單個核細胞中Fz4和sFRP1 mRNA的表達:參照TRIzol說明書提取總RNA，取已提取RNA樣本至495μl,1×TE Buffer 中，測定260nm和280nm處吸光度(A)值；A260/A280結(jié)果在1.8～2.1，抽提的RNA純度符合實驗要求。依據(jù)cDNA第一鏈合成試劑盒說明書行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。Fz4上游引物5′-CGTGACCAAGATGCCCAACCT-3′，下游引物5′-CGTACTGGATGAGCGGTGTGAA-3′，89bp；sFRP1上游引物5′-AGCTTGTGCTGTACCTGAAGAATGG-3′，下游引物5′-CATGATGAGGAAGTGGTGGCTGAG-3′，80bp；GAPDH上游引物5′-AGATCATCAGCAATGCCTCCT-3′，下游引物5′-TGAGTCCTTCCACGATACCAA-3′，90bp。PCR擴增反應體系：2×real-time PCR Master Mix 10μl，模板(cDNA稀釋10倍)1μl，上下游引物(10μmol/L)各1μl，0.1%DEPC水7μl。反應條件：95℃預變性5min；95℃變性15s，60℃退火20s，72℃延伸40s，共40個循環(huán)；95℃變性15s，驟冷至60℃，制作熔解曲線。使用ABI 7500 System SDS Software軟件，比較Ct值分析相對定量結(jié)果，mRNA相對表達量采用2-△△Ct表示。

6.Western blot法檢測骨髓單個核細胞中Fz4和sFRP1蛋白的表達:取分離所得骨髓血單個核細胞約1×107個，加入約100μl RIPA裂解液冰上裂解30min，4℃ 12000r/min離心5min，收集上清液，采用BCA法測定各樣品中蛋白的濃度。取等量(200μg)各樣品行10% SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將目的條帶半干轉(zhuǎn)至NC膜上，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出NC膜并作好標記，用TBST洗膜10min×3次。將膜放入含一抗(用Western一抗稀釋液稀釋)的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜；第2天取出，室溫振蕩30min，吸棄一抗，TBST洗10min×3次；用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗，室溫搖床振蕩反應1～2h；二抗反應結(jié)束后，回收二抗。用TBST洗膜5～10min×3顯色，使用G:BOX chemiXR5成像，使用Gel-Pro32軟件對結(jié)果進行灰度分析。

結(jié) 果

1.基本資料:50例ALL患兒，年齡6個月～13歲,患兒中位年齡4歲，其中男性26例、女性24例；20例ITP患兒，年齡5個月～14歲，患兒中位年齡3歲，其中男性9例、女性11例。各組年齡和性別構(gòu)成比比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。初發(fā)組包括HR患兒12例、IR患兒11例和LR患兒27例。

2.初發(fā)組、緩解組和對照組中Fz4、sFRP1 mRNA和蛋白的表達結(jié)果：初發(fā)組Fz4 mRNA和蛋白相對表達量均明顯高于緩解組和對照組(P<0.05)，sFRP1 mRNA和蛋白相對表達量均明顯低于緩解組和對照組(P<0.05)；緩解組、對照組中Fz4和sFRP1 mRNA、蛋白表達比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表1、圖1。

表1 各組Fz4和sFRP1 mRNA和蛋白的相對表達量

與初發(fā)組比較，*P<0.05

圖1 各組兩因子蛋白表達

3.初發(fā)組Fz4和sFRP1 mRNA和蛋白表達的相關(guān)性分析:初發(fā)組中，F(xiàn)z4、sFRP1 mRNA和蛋白相對表達量呈負相關(guān)(P<0.05),詳見表2。

表2 Fz4和sFRP1表達的相關(guān)性分析

4.不同危險度分組中Fz4和sFRP1 的表達水平：初發(fā)組中，高、中危組Fz4 mRNA和蛋白相對表達量均高于低危組(P<0.05)，高、中危組sFRP1 mRNA和蛋白相對表達量均低于低危組(P<0.05)，詳見表3，圖2。

表3 各危險度分組中Fz4和sFRP1 mRNA和蛋白的表達

與高危組比較，*P<0.05；與中危組比較，#P<0.05

圖2 不同危險度分組兩因子蛋白表達

討 論

Wnt通路是重要細胞信號轉(zhuǎn)導通路之一，在多細胞真核生物中廣泛存在，Wnt信號傳遞涉及多因子、多環(huán)節(jié)、多種調(diào)控，目前已知Wnt通路有4條，分別是經(jīng)典Wnt通路(canonical Wnt/β-catenin pathway)、平面細胞極性通路、Wnt/Ca2+通路、調(diào)節(jié)紡錘體的方向和非對稱細胞分裂的胞內(nèi)通路[9]。Wnt/β-catenin通路的研究較為廣泛，其異常激活與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預后有關(guān)[3]。

Wnt通路成分復雜，進化保守，信號級聯(lián)傳遞，F(xiàn)z是Wnt配體的核心受體，在胞膜水平，Wnt配體與Fz的半胱氨酸富集區(qū)(cysteine rich domain，CRD)特異性結(jié)合并激活通路，發(fā)揮“開關(guān)”的作用[10，11]。sFRP位于胞外，其30%～50%的CRD與Fz同源，但較Fz缺少跨膜域和胞質(zhì)域，故sFRP可競爭性結(jié)合Wnt配體或與Fz結(jié)合形成CRD二聚體，阻止Wnt信號進一步轉(zhuǎn)導，是通路的天然抑制劑[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)，初發(fā)患兒中sFRP1 mRNA和蛋白表達均低于緩解和ITP患兒，F(xiàn)z4 mRNA和蛋白均高于緩解和ITP患兒，兩因子在ALL緩解和ITP患兒表達差異無統(tǒng)計學意義；初發(fā)組患兒Fz4和sFRP1 mRNA、蛋白表達均呈負相關(guān)。研究表明，正常人骨髓單個核細胞不能擴增出sFRP1的甲基化特異性引物，而ALL細胞株Molt-4和Jurkat中sFRP1呈完全甲基化狀態(tài)，且去甲基化藥物能夠恢復sFRP1表達，并逆轉(zhuǎn)疾病進展[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，ALL兒童中sFRP1因啟動子異常甲基化而失活，sFRP1表達降低，不能與Fz4結(jié)合形成CRD二聚體或競爭性結(jié)合Wnt配體，F(xiàn)z4表達增加，Wnt信號活性增強，進一步激活下游腫瘤靶基因如Cyclin D1、c-Myc、Axin2、Msl1的轉(zhuǎn)錄，最終導致兒童ALL的發(fā)生[14～16]；誘導化療通過去甲基化恢復了sFRP1的表達，故完全緩解ALL患兒和ITP患兒，sFRP1和Fz4的表達差異無統(tǒng)計學意義。

危險度分層是兒童ALL預后獨立危險因素，不同危險度分層患兒接受化學藥物治療的強度亦不同[17]。本研究發(fā)現(xiàn)初發(fā)高危、中危ALL患兒sFRP1 mRNA和蛋白表達均低于低危患兒，初發(fā)高危、中危ALL患兒Fz4 mRNA和蛋白表達均高于低?；純?，初發(fā)高危、中危ALL患兒兩因子表達差異無統(tǒng)計學意義，可能因為不同危險程度ALL患兒sFRP1基因CpG島甲基化傾向性不同，低危組患兒sFRP1基因具有更高的表達活性，具體機制尚需進一步研究[18]。

綜上所述，研究認為，Wnt通路中Fz4表達升高、sFRP1表達降低參與了兒童ALL的發(fā)病，兩因子的表達定量對疾病的評估和治療有重要臨床指導意義。