張占琴 王 強(qiáng)

膿毒癥是一種由機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)引發(fā)危及生命的多器官功能障礙的致死性疾病[1]。據(jù)流行病學(xué)報(bào)道，膿毒癥患者約占總住院患者的2%，在重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)中其所占比例為30.2%，病死率高達(dá)55.7%[2]。膿毒癥患者常常出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，其與患者疾病的嚴(yán)重性和預(yù)后密切相關(guān)[3]。膿毒癥腦病(sepsis-associated encephalopathy，SAE)是膿毒癥最常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，目前SAE的發(fā)生率尚無(wú)定論，國(guó)外有研究報(bào)道其發(fā)生率可高達(dá)70%[4]。SAE可發(fā)生在膿毒癥的任何階段，主要臨床常表現(xiàn)為精神活動(dòng)的延遲，注意力、定向力受損等，臨床統(tǒng)計(jì)顯示腦功能損傷和患者預(yù)后呈正相關(guān)， 轉(zhuǎn)入ICU時(shí)存在昏迷的膿毒癥患者病死率高達(dá)60%，SAE是預(yù)測(cè)患者病死率的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，合并SAE顯著增加膿毒癥的治療難度[5]。此外，Iwashyna等[6]對(duì)膿毒癥存活患者進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)3年的隨訪，發(fā)現(xiàn)依然有17%患者發(fā)生中、重度認(rèn)知功能障礙。因此積極治療SAE對(duì)降低膿毒癥患者病死率及改善預(yù)后具有重要意義。

有研究表明，脂聯(lián)素缺乏增加促炎性細(xì)胞因子表達(dá)，血清中低脂聯(lián)素濃度與膿毒癥的嚴(yán)重程度具有負(fù)相關(guān)性，然而脂聯(lián)素是否具有改善膿毒癥腦損傷的作用尚未可知[7]。脂聯(lián)素可引起肌細(xì)胞線粒體數(shù)量增加，膿毒癥患者普遍存在線粒體抗氧化能力下降和活性氧、自由基過(guò)度產(chǎn)生，最終導(dǎo)致線粒體氧化還原平衡失衡，而脂聯(lián)素對(duì)膿毒癥腦損傷的保護(hù)作用是否與改善線粒體功能有關(guān)，這一問(wèn)題仍有待研究[8，9]。本研究應(yīng)用脂聯(lián)素對(duì)膿毒癥模型小鼠進(jìn)行干預(yù)，探討脂聯(lián)素治療對(duì)膿毒癥腦損傷發(fā)揮的效應(yīng)，以期為脂聯(lián)素應(yīng)用于SAE患者提供實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6～8周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量22～25g，購(gòu)自西安交通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，購(gòu)買后適應(yīng)性喂養(yǎng)3天，予自由飲食飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循國(guó)家所制定的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用的指南，并經(jīng)西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

2.主要試劑：脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(Escherichia Coli O55：B5，美國(guó)Sigma 公司)；脂聯(lián)素(以色列ProSpec公司)；活性氧(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide diamutase，SOD)檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)蛋白(B-cell lymphoma 2-Associated X，Bax)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cleaved caspase-3)和β-actin一抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)。

3.分組、模型制備和標(biāo)本采集：168只SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為空白對(duì)照組(CON組)、脂聯(lián)素對(duì)照組(APN組)、膿毒癥模型組(LPS組)、脂聯(lián)素干預(yù)組(LPS + APN組)。參照文獻(xiàn)[10]方法采用腹腔注射LPS 15mg/kg制備膿毒癥腦病模型，CON組腹腔注射等量0.9%氯化鈉注射液，LPS組側(cè)腦室注射等量0.9%氯化鈉注射液，LPS+APN組造模后30min給予側(cè)腦室注射APN 0.1μg/g。一部分小鼠(每組10只)造模24h后于麻醉下斷頭取大腦，迅速分離大腦組織，取左側(cè)大腦海馬切面置于40g/L多聚甲醛溶液中固定，右側(cè)海馬組織液氮速凍后轉(zhuǎn)于-80℃ 冰箱保存待用。其余小鼠(每組16只)造模后2周采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)完畢后處死小鼠。本研究中動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

4.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)：取一個(gè)長(zhǎng)50cm×50cm×50cm的曠場(chǎng)，箱底劃分為25個(gè)方格，造模后2周將小鼠(n=16)放入曠場(chǎng)中心方格內(nèi)，在曠場(chǎng)上方安置攝像機(jī)，記錄5min內(nèi)小鼠跨格數(shù)和站立次數(shù)。每次實(shí)驗(yàn)后清理小鼠留在曠場(chǎng)中的糞便。共進(jìn)行為期2天的測(cè)試，第1天為訓(xùn)練期，第2天為試驗(yàn)期。由于動(dòng)物對(duì)于再次進(jìn)入同一個(gè)熟悉場(chǎng)景具有適應(yīng)性的特性，該測(cè)試對(duì)跨格數(shù)和站立次數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析主要用來(lái)評(píng)估訓(xùn)練期的運(yùn)動(dòng)表現(xiàn)和試驗(yàn)期的非空間學(xué)習(xí)記憶能力。

5.跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)：造模后2周進(jìn)行為期2天的跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)(n=16)，訓(xùn)練期將小鼠放入跳臺(tái)反射箱，適應(yīng)3min后將其移上安全臺(tái)，然后底部電柵欄通電，小鼠被電擊2s后取出，并記錄其從平臺(tái)跳下來(lái)的時(shí)間，訓(xùn)練期內(nèi)如果該動(dòng)物未跳下平臺(tái)則棄之不用。試驗(yàn)期(24h后)將動(dòng)物再次放在平臺(tái)上，觀察3min，記錄小鼠從平臺(tái)跳下所需的時(shí)間，即跳臺(tái)潛伏期。如果動(dòng)物跳下平臺(tái)時(shí)受到電擊，再次放置于平臺(tái)后動(dòng)物可形成記憶而不跳下平臺(tái)，跳臺(tái)潛伏期常被用來(lái)作為評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶能力的重要指標(biāo)。

6.蘇木精-伊紅(hemotoxylin and eosin，HE)染色觀察皮質(zhì)病理改變： 造模24h后分離大腦組織(n=5)，取左側(cè)大腦海馬切面經(jīng)40g/L多聚甲醛固定后，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋，海馬組織切片后行HE染色，正置顯微鏡下采集數(shù)據(jù)并拍照。

7.海馬線粒體ROS、MDA、SOD檢測(cè)：造模24h后取右側(cè)海馬組織(n=5)，按先前方法提取線粒體，裂解液重懸后BCA法測(cè)定蛋白水平后備用[11]。將線粒體懸液稀釋至蛋白質(zhì)量濃度為1mg/ml，取50μl線粒體懸液加入反應(yīng)液，酶標(biāo)儀行定量檢測(cè)，按相應(yīng)的說(shuō)明書步驟操作，酶標(biāo)儀讀取吸光度值，按公式計(jì)算出數(shù)值后分別除以相應(yīng)蛋白濃度即得各樣本ROS、MDA、SOD水平。

8.海馬Bcl-2、Bax、cyt-c、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)的檢測(cè): 造模24h后取右側(cè)海馬組織(n=5)，提取海馬總蛋白制備上樣樣品，聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h。相繼孵育相應(yīng)的一抗和二抗之后，經(jīng)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描獲得圖像。

結(jié) 果

1.各組小鼠行為學(xué)特征：造模后2周采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)(n=16)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)(n=16)對(duì)4組小鼠進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，跨格數(shù)和站立次數(shù)的統(tǒng)計(jì)用來(lái)反應(yīng)動(dòng)物開(kāi)發(fā)新環(huán)境的運(yùn)動(dòng)能力。訓(xùn)練期各組小鼠間的跨格數(shù)和站立次數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與訓(xùn)練期比較，試驗(yàn)期CON組和APN組跨格數(shù)和站立次數(shù)顯著減少(P<0.01)，表明小鼠具有良好的記憶能力。與訓(xùn)練期比較，LPS組小鼠跨格數(shù)和站立次數(shù)并未有明顯改變，脂聯(lián)素干預(yù)(LPS+APN組)后，小鼠跨格數(shù)和站立次數(shù)減少(P<0.01)。在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，訓(xùn)練期各組小鼠從跳臺(tái)跳下來(lái)的時(shí)間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與訓(xùn)練期比較，試驗(yàn)期CON組和APN組跳臺(tái)潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.01)，同樣表明小鼠具有良好的記憶能力。在試驗(yàn)期，與CON組比較，LPS組跳臺(tái)潛伏期延遲顯著降低，提示記憶受損(P<0.01)；與LPS組比較，脂聯(lián)素干預(yù)(LPS+APN)組可顯著延長(zhǎng)潛伏期(P<0.05)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 4組小鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)行為學(xué)特征(n=16)A.曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)；B.跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)；與訓(xùn)練期比較，#P<0.01

2.各組小鼠海馬形態(tài)學(xué)改變：選取海馬CA1區(qū)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,CON組和APN組小鼠神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列規(guī)則致密，神經(jīng)元胞質(zhì)豐富，胞核大而圓，核仁清楚(圖2中A、B)；LPS組可見(jiàn)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，神經(jīng)元數(shù)量減少，神經(jīng)元空泡樣改變，核固縮、深染(圖2C)；與LPS組比較，LPS+APN組多數(shù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元數(shù)量明顯增多，發(fā)生空泡樣變、核固縮以及深染的神經(jīng)元減少(圖2D)。

圖2 4組小鼠海馬形態(tài)學(xué)改變(n=5，HE染色，×400)A.CON組；B.APN組；C.LPS組；D.LPS+APN組

3.各組小鼠海馬氧化損傷情況：與CON組比較，LPS組小鼠海馬線粒體ROS和MDA水平升高，SOD活力下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ROS：P<0.05；MDA：P<0.01；SOD：P=0.000)；與LPS組比較，LPS+APN組線粒體ROS和MDA水平下降，SOD活力增強(qiáng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ROS：P<0.05；MDA：P<0.05；SOD：P=0.000)，詳見(jiàn)表1。

表1 4組小鼠海馬線粒體ROS、MDA和SOD表達(dá)情況

與CON組比較，*P<0.05，**P<0.01,***P=0.000;與LPS組比較，#P<0.05,##P=0.000

4.各組小鼠海馬凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況：造模24h后取右側(cè)海馬組織檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)，與CON組比較，LPS組小鼠海馬Bcl-2表達(dá)下降(P=0.000)，Bax和cleaved caspase-3表達(dá)升高(Bax：P=0.000；cleaved caspase-3：P<0.01)；與LPS組比較，LPS+APN組小鼠海馬Bcl-2表達(dá)升高(P=0.000)，Bax和cleaved caspase-3表達(dá)下降(Bax：P<0.01；cleaved caspase-3：P<0.01)，詳見(jiàn)圖3和表2。

討 論

脂聯(lián)素是良好的胰島素增敏劑，抗炎調(diào)節(jié)劑和抗動(dòng)脈粥樣硬化分子，脂聯(lián)素缺乏增加促炎性細(xì)胞因子表達(dá)，放大肥胖和膿毒癥中促炎表型，補(bǔ)充脂聯(lián)素后通過(guò)調(diào)控氧化/硝化應(yīng)激反應(yīng)減輕LPS所致膿毒癥炎癥性肺損傷和心肌損傷程度等，其可能成為改善膿毒癥相關(guān)臟器功能損傷以及預(yù)后的潛在治療靶點(diǎn)或藥物[12,13]。SAE發(fā)生率高，治療難度大，然而其病理生理機(jī)制尚不十分明確且未有突破性進(jìn)展[5，14，15]。目前已經(jīng)公認(rèn)腹腔注射LPS能夠普遍引起腦損傷，本研究采用腹腔注射LPS制備膿毒癥模型，探索脂聯(lián)素對(duì)膿毒癥腦損傷的作用及機(jī)制。結(jié)果顯示LPS組和LPS+APN組小鼠HE染色見(jiàn)空泡樣變、核固縮以及深染等病理改變，提示LPS可引起膿毒癥小鼠腦組織損傷。與LPS組比較，LPS+APN組空泡樣變、核固縮以及深染等病理改變有所減輕，且使用脂聯(lián)素干預(yù)后LPS+APN組小鼠在曠場(chǎng)和跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出的學(xué)習(xí)記憶能力有所改善，表明脂聯(lián)素對(duì)膿毒癥小鼠腦組織損傷具有一定的保護(hù)作用。

圖3 4組小鼠海馬內(nèi)Bcl-2、cleaved caspase-3和Bax蛋白表達(dá)

表2 各組細(xì)胞中Bcl-2、cleaved caspase-3和Bax蛋白表達(dá)

與CON組比較，*P<0.05，**P<0.01,***P=0.000;與LPS組比較，#P<0.01,##P=0.000

已有研究表明ROS生成增多、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等與SAE的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9,16]。線粒體作為細(xì)胞的能量工廠，不僅參與細(xì)胞能量供應(yīng)、鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激、凋亡等生理過(guò)程，更為重要的是，匯聚于線粒體的各種細(xì)胞信號(hào)通路以及線粒體釋放的各種關(guān)鍵因子，是決定細(xì)胞存活的最終通路[17]。脂聯(lián)素通過(guò)脂聯(lián)素受體1誘導(dǎo)細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流、激活Ca2+/CaMKKβ、AMPK和SIRT1和減少PGC-1α乙酰化，最終引起肌細(xì)胞線粒體數(shù)量增加，這些研究結(jié)果提示脂聯(lián)素在改善線粒體功能方面具有重要作用[8]。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥小鼠海馬線粒體中ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA生成增多，而抗氧化酶SOD活力下降，提示膿毒癥腦組織損傷發(fā)生時(shí)線粒體氧化應(yīng)激明顯增強(qiáng)。APN干預(yù)后，海馬線粒體中ROS和MDA水平降低，而SOD活力增強(qiáng)，說(shuō)明脂聯(lián)素可減少膿毒癥小鼠海馬線粒體氧化應(yīng)激，從而發(fā)揮抗氧化保護(hù)作用。

線粒體是過(guò)量ROS產(chǎn)生后的主要促凋亡靶點(diǎn)，ROS大量產(chǎn)生引起線粒體膜脂質(zhì)過(guò)氧化、線粒體膜上蛋白質(zhì)和線粒體DNA氧化損傷，隨后線粒體膜通透性增加和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放使Ca2+、Cyt-c、凋亡誘導(dǎo)因子AIF等大量釋放，激活pro-caspase-9進(jìn)而觸發(fā)caspases級(jí)聯(lián)效應(yīng)引起細(xì)胞凋亡[18]。過(guò)量的活性氧也可使線粒體電子傳遞鏈解偶聯(lián)，下調(diào)ATP產(chǎn)生水平，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平，最后使線粒體外膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19，20]。在本研究中，膿毒癥小鼠海馬凋亡細(xì)胞明顯增多，且Bcl-2表達(dá)減少，而B(niǎo)ax和cleaved caspase-3表達(dá)增加，提示膿毒癥腦損傷發(fā)生與線粒體凋亡通路激活有關(guān)，這與先前的其他研究結(jié)果一致[21,22]。雖然目前有相當(dāng)多的證據(jù)表明脂聯(lián)素及其受體在大腦中廣泛表達(dá)，只有少數(shù)研究關(guān)注了脂聯(lián)素在腦功能紊亂中的作用以及修飾脂聯(lián)素信號(hào)通路的藥物的治療潛力，它們?cè)谀X疾病中的確切作用仍不十分清楚。本研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素干預(yù)后，Bcl-2表達(dá)上調(diào)，而B(niǎo)ax和cleaved caspase-3表達(dá)減少，提示脂聯(lián)素可通過(guò)抑制線粒體促凋亡通路激活在膿毒癥腦損傷中發(fā)揮抗凋亡作用。

綜上所述，本研究顯示線粒體功能障礙和線粒體促凋亡通路激活可能參與了膿毒癥腦損傷的發(fā)病過(guò)程，而脂聯(lián)素則通過(guò)減少膿毒癥小鼠海馬線粒體氧化應(yīng)激抑制線粒體促凋亡通路激活，從而在膿毒癥腦損傷中發(fā)揮保護(hù)作用，為臨床運(yùn)用脂聯(lián)素治療SAE提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究只針對(duì)脂聯(lián)素進(jìn)行了探討，而海馬脂聯(lián)素受體及其參與脂聯(lián)素作用的具體分子機(jī)制仍不明確，有待于進(jìn)一步研究。