周 恒 唐其柱 沈滌非 嚴 玲 卞洲艷 袁 園

心肌肥厚是心臟負荷增加或遭受損傷時的一種代償性反應，雖然在早期可以減輕心室壁壓力和維持心排出量，但長期持續(xù)的心肌肥厚會發(fā)展為失代償，導致心室功能障礙，最終發(fā)生心力衰竭[1]。壓力負荷是心肌肥厚最常見的原因之一，高血壓、主動脈瓣狹窄等疾病均會導致左心室壓力負荷的升高，促進心肌肥厚發(fā)生。心肌肥厚涉及心肌細胞增大和功能障礙、間質纖維化等多種病理生理反應，參與心肌肥厚的分子機制也非常復雜，目前尚未完全闡明。雖然針對神經(jīng)體液機制的治療能夠在一定程度上改善心肌肥厚，但是仍有相當數(shù)量的心肌肥厚與心力衰竭患者療效不佳[2]。探索心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展機制，尋找潛在的防治靶點，對于減少高血壓等心血管疾病的并發(fā)癥、遏制心力衰竭的發(fā)展具有重要意義。

近年來研究顯示，炎性反應與心肌肥厚及心力衰竭關系密切，可能成為調節(jié)心肌肥厚進程的新靶點[3]。轉化生長因子活化激酶1(transforming growth factor-β activated kinase 1, TAK1)是促炎細胞信號轉導通路中的關鍵分子，能夠激活下游的核因子(nuclear factor, NF)-κB，促進炎性細胞因子釋放，介導炎性反應發(fā)生[4]。然而，TAK1在心肌肥厚中的作用尚不明確。本研究擬通過胸主動脈縮窄術(aortic banding, AB)建立壓力負荷誘導的心肌肥厚模型，檢測心肌組織中TAK1/NF-κB與炎性反應水平，以探索TAK1/NF-κB介導的炎性反應在心肌肥厚中的作用，為防治心肌肥厚與心力衰竭提供新的潛在分子靶點。

材料與方法

1.實驗動物：以8～10周齡、體質量23.5～27.5g的雄性野生型C57BL/6J小鼠為研究對象。小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物中心的獨立送回風凈化籠具(IVC)中，飲用水經(jīng)高壓處理，飼料經(jīng)60Co照射滅菌。系統(tǒng)溫度維持于22～24℃，濕度為50%～60%， 12h明暗交替。小鼠隨機分為兩組：假手術對照(Sham)組與心肌肥厚模型(AB)組。

2.心肌肥厚模型的建立：采用胸主動脈縮窄術建立小鼠心肌肥厚模型。腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，沿第2～3肋間水平切開皮膚，分離肌肉及軟組織，游離胸主動脈，以7-0手術縫線橫穿主動脈下方，將去尖的26G(小鼠體質量25.0～27.5g)或27G(小鼠體質量23.5～25.0g)注射器針頭平行放置于血管上方，針頭連同主動脈一起結扎，隨后立即抽出針頭，使用超聲多普勒檢測評估主動脈狹窄程度，以確定手術造成了主動脈約70%狹窄[5]。對照組在分離出主動脈后，只掛線不結扎，其余手術步驟與AB組相同。術后8周進行各項指標檢測。

3.超聲心動圖：異氟烷(1.5%～2.0%)持續(xù)吸入麻醉，麻醉狀態(tài)穩(wěn)定后，小鼠左側臥位，采用高頻超聲診斷儀，頻率為15MHz。取胸骨旁左心室乳頭肌水平短軸切面，測量舒張期室間隔厚度(IVSD)、舒張期左心室后壁厚度(LVPWD)、左心室收縮末期內徑(LVESD)、左心室舒張末期內徑(LVEDD)以及短軸縮短率(FS)等指標。

4.心臟取材：稱量小鼠體質量，采用頸椎脫臼法處死小鼠，立即取出心臟，稱量心臟質量。取材完成后半數(shù)心臟放至-80℃冰箱保存，用于Western blot法與RT-PCR法檢測。其余心臟放入4%甲醛溶液中固定，用于病理學與免疫熒光檢測。

5.病理學檢測：將固定后的小鼠心臟橫切，進行脫水、透明、浸蠟，包埋入石蠟塊。制備出4～5μm厚的組織切片，進行常規(guī)HE與天狼猩紅染色，顯微鏡下觀察、拍照。使用圖像分析軟件(Image Pro-Plus 6.0)計算心肌細胞橫截面積與心肌組織膠原容積分數(shù)。

6.免疫熒光：組織切片采用檸檬酸鹽高壓修復法進行抗原修復，10%羊血清37℃孵育60min進行封閉。CD68一抗4℃孵育過夜，綠色熒光標記的二抗?jié)窈兄?7℃孵育60min。滴加含有DAPI的封片劑封片，放置5min左右后，在熒光顯微鏡下觀察、拍照。拍照時在同一視野下分別拍攝綠色激發(fā)熒光與藍色激發(fā)熒光兩張圖片，并使用Image-pro plus 6.0軟件合成，計算各組CD68陽性細胞數(shù)。

7.實時定量RT-PCR法：TRIzol提取心肌組織總RNA，分光光度法檢測RNA純度及濃度。每個樣本取2μg總RNA，使用反轉錄試劑盒(20μl反應體系)進行反轉錄。得到的cDNA以LightCycler 480 SYBR Green 1 Master Mix反應體系進行PCR擴增：95℃變性10min，隨后95℃ 15s進行40個循環(huán)，GAPDH作為內參。

8.Western blot法：使用RIPA裂解液研磨心肌組織，BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE進行分離，然后轉移至PVDF膜，于封閉液中封閉2h。繼以待測蛋白的一抗4℃孵育過夜，熒光標記的二抗室溫孵育1h，置于雙通道熒光掃描儀中掃膜，計算機分析結果。

結 果

1.超聲心動圖與心臟質量：AB術后8周的模型組小鼠左心室室壁厚度與室腔大小明顯增加，而短軸縮短率明顯下降，出現(xiàn)了明顯的左心室結構異常與心功能障礙(表1)。心肌肥厚模型組小鼠心臟質量/體質量(HW/BW, mg/g)較對照組明顯增加(4.07±0.12mg/g vs 8.07±0.45mg/g,P<0.05)。

表1 兩組小鼠超聲心動圖檢測結果

與Sham組比較，*P<0.05

2.病理學檢測結果：HE染色顯示，模型組小鼠心肌細胞排列紊亂，橫截面積較對照組明顯增大，出現(xiàn)了明顯的心肌肥厚(圖1)。PSR染色顯示，模型組小鼠組織間隙染為紅色的膠原成分明顯增多，心肌組織膠原沉積、纖維化(圖2)。

圖1 心肌組織HE染色結果(×400)A.Sham組；B.AB組

圖2 心肌組織PSR染色結果(×400)A.Sham組；B.AB組

3.肥厚心肌組織中炎性反應增加：通過CD68免疫熒光標記單核-吞噬細胞，檢測心肌組織炎性浸潤情況。心肌肥厚模型組小鼠心肌組織中CD68陽性細胞數(shù)明顯多于對照組(圖3)。此外，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，心肌組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與白介素-1β(IL-1β)等炎性反應標志物的mRNA表達水平在模型組中明顯升高(圖4)。

圖3 心肌組織CD68免疫熒光檢測(×400)

4.肥厚心肌組織中TAK1/NF-κB通路激活：Western blot法檢測結果顯示，心肌肥厚模型組小鼠心肌組織中TAK1、κB抑制蛋白激酶β(IKKβ)與κB抑制蛋白α(IκBα)的磷酸化水平較對照組明顯上調，IκBα總蛋白水平降低，NF-κB p65磷酸化水平增加，TAK1/NF-κB信號通路的激活(圖5)。

圖4 心肌組織炎性反應標志物表達結果A.TNF-α；B.IL-1β

圖5 肥厚心肌組織中TAK1/NF-κB信號通路的激活

討 論

心肌肥厚是心力衰竭的關鍵性臨床階段，是多種心血管疾病向心力衰竭發(fā)展的共有病理生理過程，涉及心肌細胞增大、排列紊亂和功能障礙、間質纖維化等多種病理改變。本研究通過主動脈縮窄術成功建立了壓力負荷誘導的心肌肥厚模型，并使用超聲心動圖、HE與PSR染色進行評估，在術后8周觀察了模型組小鼠心肌肥厚、室腔擴大、心功能不全以及各種病理學表現(xiàn)。

然而，參與心肌肥厚的分子機制非常復雜，迄今尚未完全闡明。近年來，炎性反應及其相關信號通路在心肌肥厚中的作用逐漸受到重視。臨床研究顯示，左心室肥厚患者體內存在系統(tǒng)性炎性反應，其血清中的炎性反應標志物 CRP 以及促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β與IL-6的表達均明顯升高[6]。另外，心肌組織中包括心肌細胞在內的多種細胞能夠分泌炎性細胞因子，并表達炎性細胞因子受體；心臟既是炎性細胞因子產(chǎn)生的場所，也是其作用的靶器官[7]。因此，炎性反應不僅僅是心肌肥厚與心力衰竭的標志物與預后指標，同時參與了心肌肥厚的進程，與心肌細胞肥大與心肌間質纖維化等病理過程密切相關[8]。本研究顯示，心肌肥厚模型組小鼠心肌組織中CD68陽性細胞數(shù)明顯增多，TNF-α與IL-1β等炎性反應標志物的mRNA表達水平也明顯升高，提示心肌出現(xiàn)炎性細胞浸潤與促炎性細胞因子的產(chǎn)生。

NF-κB是調節(jié)炎性反應的關鍵轉錄因子，在細胞生長、增殖、凋亡和細胞外基質重塑等多種病理生理過程中也發(fā)揮重要作用[9]。NF-κB二聚體(經(jīng)典組合為p65和p50)通過與NF-κB抑制劑(IκBs)結合而失活，IκBs在靜息狀態(tài)的細胞胞質維持NF-κB的穩(wěn)定[10]。而在應激情況下，IκBs可被IκB激酶(IKKs，如IKKβ)磷酸化，導致IκBs的泛素化并降解，解除IκBs對NF-κB的抑制，進而引起NF-κB的釋放和活化[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的大鼠心肌細胞中，NF-κB可被多種肥厚刺激物激活，包括血管緊張素Ⅱ、苯腎上腺素和內皮素-1[12]。本研究結果顯示，AB組IKKβ與IκBα的磷酸化水平較對照組明顯上調，IκBα總蛋白水平降低，NF-κB p65磷酸化水平增加，進一步證實NF-κB信號通路可在壓力負荷誘導的心肌肥厚中激活。

但是，NF-κB在心肌肥厚中的作用尚存爭議。過表達NF-κB會促進肥厚刺激引起的心房利鈉肽的表達和心肌細胞的增大，而超抑制型IκBα突變體或顯性負性IKKβ突變體的表達會抑制NF-κB并減輕這些肥厚[12]。小鼠心臟特異性p65缺失可緩解壓力負荷誘導的心肌肥厚，改善病理性心肌重構，增強心臟收縮功能[13]。以sh-p65 RNA轉染心臟，抑制NF-κB，可減輕Myo轉基因小鼠的自發(fā)性心肌肥厚[14]。這些發(fā)現(xiàn)提示NF-κB具有促進心肌肥厚的作用，然而，也有一些研究存在相反的結果。Hikoso等[15]報道，心臟特異性敲除IKKβ會降低NF-κB活性，但卻加重了壓力負荷誘導的心肌肥厚、心室擴張以及心功能障礙。NF-κB必須調節(jié)蛋白(NF-κB-essential modulator, NEMO)是IKK復合物的調節(jié)亞基，通過其心臟特異性缺失可抑制NF-κB通路，并促進壓力負荷誘導的心肌肥厚與心力衰竭[16]。這些結果則提示NF-κB通路對心肌肥厚也具有保護作用。NF-κB在心肌肥厚中作用不一致的原因可能是由于模型構建的不同、實驗環(huán)境的不同、NF-κB作用靶點的多樣性以及NF-κB上游調控分子的多樣性所導致的。

TAK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，能夠被轉化生長因子-β、Toll樣受體、NOD樣受體等多種因素激活，是NF-κB信號通路關鍵的上游調節(jié)因子[17]。TAK1可以使IKK磷酸化，激活IKK復合物，促進IκB的磷酸化與降解，致使NF-κB的游離及活化入核，誘導TNF-α等促炎性細胞因子表達[18,19]。但是，心肌肥厚過程中TAK1的作用及其與NF-κB和炎性反應的關系，尚不明確。本研究在心肌肥厚小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，TAK1的磷酸化水平較對照組明顯增加，與NF-κB p65的變化趨勢一致，同時伴有心肌組織炎性浸潤，提示TAK1可能作為上游分子激活NF-κB以及炎性反應，并參與心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，本研究在壓力負荷誘導的小鼠心肌肥厚模型中，發(fā)現(xiàn)了TAK1/NF-κB通路的激活與心肌組織炎性浸潤，提示TAK1/NF-κB及其介導的炎性反應參與了心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展，為探索心肌肥厚的分子機制與尋找潛在的防治靶點提供了一定的理論基礎。