鄭玉蘭 徐 貞 李如珊 林創(chuàng)明 馬盛琴 劉云松

（廣東祈福醫(yī)院，廣東 廣州 511495）

急性腦梗死是因血栓導(dǎo)致腦動脈閉塞進(jìn)而引起腦組織局部血液供應(yīng)障礙，可導(dǎo)致不可逆局灶性腦損傷，其發(fā)病率高、致殘率高以及死亡率高[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死患者在發(fā)生和發(fā)展中多伴有炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激被認(rèn)為是導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損的主要因素。近年研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9/TIMP-1系統(tǒng)與腦梗死患者中血腦屏障損傷和修復(fù)密切相關(guān)[2]，可為缺血性腦血管病的治療提供新思路。急性腦梗死屬于中醫(yī)“中風(fēng)”范疇，氣虛、瘀阻、血瘀是公認(rèn)的中風(fēng)病病因[3]。腦栓通膠囊具有活血通絡(luò)、祛風(fēng)化痰之功效。本研究通過建立急性腦梗死大鼠模型，以探討腦栓通膠囊對急性腦梗死大鼠炎癥因子、MMP-9和TIMP-1表達(dá)及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響，旨在為探討腦栓通膠囊作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物

60只SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半，購于上海邦耀生物科技有限公司。大鼠置于（23±2）℃室溫中，12 h/12 h晝夜節(jié)律，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)環(huán)境7 d后于9∶00～17∶00進(jìn)行實(shí)驗。

1.2 試藥與儀器

腦栓通膠囊（主要成分：蒲黃、赤芍、郁金、天麻、漏蘆等；廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20040093），給藥劑量參照《藥理實(shí)驗方法學(xué)》[4]中人和動物體表面積折算的等效劑量比值表計算；尼莫地平片（拜耳醫(yī)藥保健公司，生產(chǎn)批號：L01984）。Anti-MMP9（Sigma公司），TIMP-1抗體（ab81282）（Abcam公司），β-Actin（SANTACRUZ公司），超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（碧云天公司），Trizol試劑盒（武漢博士德生物工程公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH）以及過氧化氫酶（CAT）檢測試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）以及白介素-6（IL-6）ELISA試劑盒和DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司；C反應(yīng)蛋白（CRP）試劑盒購于上海金穗生物科技有限公司，PBS緩沖液和二抗由碧云天生物技術(shù)研究所提供；其他試劑均為分析純購于天津市廣成化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉注射液（批號：181203）由山東康寧藥業(yè)有限公司提供，實(shí)驗用水為超純水。TD5A-WS/TD5AWS型低速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)有限公司），164-5050型電泳儀（美國Bio-Rad公司），BX61型顯微鏡（日本OLYMPUS公司），Im?age-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司），pH計（北京屹源電子科技有限公司），超低溫冰箱[冠森生物科技（上海）有限公司]，電子天平（上海良平儀器有限公司），控溫水浴箱GKC（上海蘇達(dá)實(shí)驗儀器有限公司）。

1.3 造模與分組

參考文獻(xiàn)[5]制備急性腦缺血大鼠模型，將模型組及用藥組（陽性組和實(shí)驗組）大鼠水合氯醛麻醉，俯臥固定于手術(shù)臺，采用改良線栓法制作腦缺血大鼠模型，即分離并充分暴露大鼠的頸總動脈、頸內(nèi)動脈以及頸外動脈，對頸總動脈近端和頸外動脈進(jìn)行結(jié)扎，用血管夾夾閉頸內(nèi)動脈，在頸總動脈剪一切口，將線栓經(jīng)頸總動脈送至頸內(nèi)動脈至大腦中動脈起始處，阻斷血流2 h后將線栓取出恢復(fù)灌注。參照Zea Longa[6]法評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分，1～3分表明造模成功。分組分籠飼養(yǎng)，不禁食水。假手術(shù)組大鼠僅用玻璃分針游離出雙側(cè)頸總動脈不做結(jié)扎處理。

1.4 給藥方法

造模成功后，假手術(shù)組自由飲水進(jìn)食，模型組開始灌服純凈水，實(shí)驗組開始灌服腦栓通膠囊，劑量120 mg/kg，陽性組開始以10 mg/kg的劑量灌服尼莫地平。各組每天灌胃1次，連續(xù)7 d。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

1.5.1 神經(jīng)功能評分 采用Bederson評分分級法，于術(shù)后7 d對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分并記錄結(jié)果。采用改良NSS評分標(biāo)準(zhǔn)對各組大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評分（16分制），得數(shù)越高，損傷程度越重。

1.5.2 炎癥因子檢測 7 d后收集3 mL腹動脈血，離心，分離血清，ELISA法檢測TNF-α、IL-1β以及IL-6炎癥因子水平，采用免疫比濁法檢測CRP含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.5.3 MMP-9、TIMP-1表達(dá)檢測 進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評分后，采用水合氯醛溶液麻醉大鼠，斷頭取腦，于-80℃條件下凍存，在研缽內(nèi)研磨粉碎，組織勻漿器勻漿。1）采用RT-PCR法檢測MMP-9、TIMP-1基因表達(dá)，其中β-actin上游引物序列為5′-GAGGC CCAGAGCAAGAGAGGT-3′，下游引物序列為 5′-TTC ACGGTTGGCCTTAGGGTT-3′；MMP-3上游引物序列為5′-AAGGAGAGGCTGACATAATGA-3′，下游引物序列為 5′-ATCTGTCCATCGTTCATCATC-3′；TIMP-1 上游引物序列為 5′-GACCACCTTATACCAGCGTTA-3′，下游引物序列為5′-GTGCAAATTTCCGTTCCTTAA-3′。使用 Trizol試劑盒提取總 RNA，加入 20 μL DEPC水溶解，采用紫外分光光度計證實(shí)0.1 g瓊脂糖凝膠電泳中含有兩條帶（18 s和28 s）用于反轉(zhuǎn)錄的標(biāo)本，校正每組總RNA濃度，加入181 μL Oligod（T），72 ℃條件下變性10 min，取出立即置于冰上2 min。后加入11.5 μL DEPC水，2.5 μL 5Xbuffer，0.5 μL dNTP Mix?ture，0.5 μL RNase，0.5 μL M-MLV，室溫下靜置10 min。然后42℃水浴條件下1 h，冰上放置2 min。放入熒光定量PCR儀中，采用25 μL反應(yīng)體系，觀察熒光定量熔解度。2）采用Western blotting法檢測MMP-9、TIMP-1蛋白的表達(dá)，提取總蛋白質(zhì)后根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒操作步驟測定蛋白質(zhì)濃度。使用熒光成像儀觀察相關(guān)蛋白的表達(dá)，使用Image J分析軟件分析所得圖像中條帶的光密度值，以靶蛋白β-actin灰度比值作為蛋白的相對表達(dá)豐度。

1.5.4 氧化應(yīng)激指標(biāo)測定 取大鼠腦漿液，離心，取上清液，采用硫代巴比妥酸比色法檢測血清丙二醛（MDA）含量，采用黃嘌呤氧化酶法檢測血清超氧物歧化酶（SOD）含量，采用紫外吸收法測過氧化氫酶（CAT）含量，采用比色法檢測谷胱甘肽過氧化物酶（GSH），嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和神經(jīng)行為學(xué)評分比較

見表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的神經(jīng)功能評分和神經(jīng)行為學(xué)評分明顯高升高，具有顯著差異（P＜0.05）。給予藥物干預(yù)后，陽性組和實(shí)驗組大鼠的神經(jīng)功能評分和神經(jīng)行為學(xué)評分明顯低于模型組（P＜0.05），兩組比較亦有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和神經(jīng)行為學(xué)評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和神經(jīng)行為學(xué)評分比較（分，±s）

與假手術(shù)組比較，?P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與陽性組比較，△P＜0.05。下同

神經(jīng)行為學(xué)評分00.00±00.00 5.72±1.12*3.28±0.49*#3.05±0.52*#△組別假手術(shù)組模型組陽性組實(shí)驗組n 15 15 15 15神經(jīng)功能評分0.00±0.00 5.86±1.21*3.63±0.81*#3.12±0.76*#△

2.2 各組大鼠炎癥因子比較

見表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的TNF-α、CRP、IL-1β以及 IL-6水平明顯升高（P＜0.05）。給予藥物干預(yù)后，陽性組和實(shí)驗組大鼠的炎癥因子水平明顯降低（P＜0.05），兩組比較有顯著差異（P＜0.05）。

表2 各組大鼠炎癥因子比較（μg/mL，±s）

表2 各組大鼠炎癥因子比較（μg/mL，±s）

組別假手術(shù)組模型組陽性組實(shí)驗組n 15 15 15 15 TNF-α 39.89±6.16 54.75±7.08*47.09±7.14*#41.28±7.32*#△CRP 32.14±4.59 51.23±3.12*40.12±3.74*#35.47±5.26*#△IL-1β 4.53±0.67 6.72±0.85*4.66±0.54*#4.69±0.71*#△IL-6 21.12±2.67 30.47±3.86*23.57±3.45*#23.87±3.09*#△

2.3 各組大鼠MMP-9和TIMP-1表達(dá)比較

見表3，圖1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的MMP-9基因表達(dá)和MMP-9蛋白表達(dá)的相對豐度值明顯升高，TIMP-1基因表達(dá)和TIMP-1蛋白表達(dá)的相對豐度值明顯降低，具有顯著差異（P＜0.05）。給予藥物干預(yù)后，陽性組和實(shí)驗組大鼠的MMP-9基因表達(dá)和MMP-9蛋白表達(dá)的相對豐度值明顯低于模型組，TIMP-1基因表達(dá)和TIMP-1蛋白表達(dá)的相對豐度值明顯高于模型組（P＜0.05），兩組比較亦有顯著差異（P＜0.05）。

表3 各組大鼠MMP-9和TIMP-1表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠MMP-9和TIMP-1表達(dá)比較（±s）

組別假手術(shù)組（n=15）模型組（n=15）陽性組（n=15）實(shí)驗組（n=15）基因表達(dá)蛋白表達(dá)的相對豐度值基因表達(dá)蛋白表達(dá)的相對豐度值基因表達(dá)蛋白表達(dá)的相對豐度值基因表達(dá)蛋白表達(dá)的相對豐度值MMP-9 0.656±0.045 0.597±0.084 1.572±0.206*0.942±0.091*0.908±0.108*#0.734±0.041*#0.723±0.10*#▲0.617±0.037*#▲TIMP-1 10.471±1.716 0.743±0.094 8.037±1.038*0.483±0.027 9.053±1.101*#0.548±0.100*#9.721±1.526*#▲0.619±0.091*#▲

圖1 各組大鼠MMP-9、TIMP-1蛋白表達(dá)

2.4 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

見表4。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的MDA水平明顯升高，SOD、GSH以及CAT水平明顯降低，具有顯著差異（P＜0.05）。給予藥物干預(yù)后，陽性組和實(shí)驗組大鼠的MDA水平明顯低于模型組，SOD、GSH以及CAT水平明顯高于模型組（P＜0.05），兩組比較有顯著性差異（P＜0.05）。

表4 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）

表4 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組陽性組實(shí)驗組n 15 15 15 15 MDA（mmol/mL）5.27±1.13 10.81±2.53*7.24±1.34*#6.32±1.51*#△SOD（U/mL）180.81±20.27 116.68±15.46*142.85±21.32*#136.89±13.31*#△GSH（U/mg）46.07±2.57 18.63±1.84*34.53±0.78*#29.56±0.81*#△CAT（U/mg）5.67±1.08 1.93±0.65 3.19±0.36 2.50±0.21*#△

3 討論

急性腦梗死是一種炎癥相關(guān)性疾病[7-8]，腦缺血后存在炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)釋放大量的氧自由基、一氧化氮、興奮性氨基酸等毒性物質(zhì)，可明顯造成腦組織不可逆的損傷，可誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加重腦損傷[9]。研究證實(shí)，TNF-α、IL-1β、IL-6以及CRP均參與急性腦梗死的發(fā)生發(fā)展過程。TNF-α是炎癥反應(yīng)的起始因子，可誘導(dǎo)動脈粥樣硬化的形成，促進(jìn)腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡[10]。IL-1β通過激活內(nèi)皮細(xì)胞促使血栓形成，或增加誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子表達(dá)，使大量中性粒細(xì)胞浸潤到腦組織，誘發(fā)炎性反應(yīng)，是腦缺血損傷的病理生理基礎(chǔ)。CRP與低密度脂蛋白特異性結(jié)合后，可刺激黏附分子大量產(chǎn)生，進(jìn)而損害血管內(nèi)皮功能。

研究發(fā)現(xiàn)，MMP-9/TIMP-1與急性腦梗死患者腦梗死的梗死面積、出血轉(zhuǎn)化及預(yù)后密切相關(guān)[11-12]，是其損傷和修復(fù)的關(guān)鍵啟動因素。研究MMP的特殊抑制劑或提高內(nèi)源性TIMP水平，開發(fā)具有調(diào)控MMP/TIMP平衡的治療方法，將為缺血性腦卒中的治療提供新的思路。MMPs作為金屬蛋白酶參與BBB完整性以及腦梗死溶栓后出血轉(zhuǎn)化，其中MMP-9與BBB完整性破壞的關(guān)系最為密切[13]。TIMP-1由巨噬細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞產(chǎn)生，其分泌受多種細(xì)胞因子影響，可對MMP-9產(chǎn)生抑制作用。

氧化應(yīng)激是缺血性腦血管疾病中尤為重要的一個發(fā)病機(jī)制。急性腦梗死可使氧自由基大量產(chǎn)生，增加氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)神經(jīng)毒性損傷導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[14]。SOD為清除氧自由基的特異性酶，是清除自由基連鎖反應(yīng)的標(biāo)志物[15]。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的穩(wěn)定代謝物。CAT是抗氧化酵素系統(tǒng)的重要一員，可發(fā)生過氧化氫的歧化，使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害[16]。GSH是一種含γ-酰胺鍵和巰基的三肽，與SOD一起參與細(xì)胞中抗氧化作用。

中醫(yī)認(rèn)為急性局灶性腦缺血因痰瘀互結(jié)、腦脈不通所致，兼夾氣血、脾胃升降失調(diào)，治宜活血醒腦開竅。腦栓通膠囊由蒲黃、赤芍、郁金、天麻、漏蘆組成，具有活血通絡(luò)，祛風(fēng)化痰之功效，用于風(fēng)痰瘀血痹阻脈絡(luò)引起的缺血性中風(fēng)病中經(jīng)絡(luò)急性期和恢復(fù)期。方中蒲黃、赤芍化瘀止痛；郁金活血行氣、止痛解郁；天麻熄風(fēng)止痙、平抑肝陽、祛風(fēng)通絡(luò)；漏蘆清熱解毒散結(jié)，諸藥合用具有活血通絡(luò)，祛風(fēng)化痰之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[17]，腦栓通膠囊可降低血瘀模型大鼠的全血黏度、全血還原黏度、血漿黏度，延長血栓形成時間，可有效抑制對結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈致實(shí)驗性不完全缺血模型大鼠的腦血管通透性，改善大腦中動脈阻塞致局灶性腦缺血模型大鼠的神經(jīng)癥狀，降低腦梗死范圍。

本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的神經(jīng)功能評分和神經(jīng)行為學(xué)評分、TNF-α、CRP、IL-1β以及IL-6水平、MMP-9基因表達(dá)和MMP-9蛋白表達(dá)的相對豐度值以及MDA水平明顯高升高，TIMP-1基因表達(dá)和TIMP-1蛋白表達(dá)的相對豐度值、SOD、GSH以及CAT水平明顯降低，具有顯著差異。藥物干預(yù)后，陽性組和實(shí)驗組大鼠的神經(jīng)功能評分和神經(jīng)行為學(xué)評分、炎癥因子、MMP-9基因表達(dá)和MMP-9蛋白表達(dá)的相對豐度值明顯低于模型組，TIMP-1基因表達(dá)和TIMP-1蛋白表達(dá)的相對豐度值、SOD、GSH以及CAT水平明顯高于模型組，兩組比較均有顯著差異。提示腦栓通膠囊能有效地降低急性腦梗死大鼠的神經(jīng)功能評分和神經(jīng)行為學(xué)評分，降低炎癥因子和自噬相關(guān)蛋白水平，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，腦栓通膠囊可有效地降低急性腦梗死模型大鼠炎癥因子水平，改善MMP-9和TIMP-1表達(dá)，減輕其氧化應(yīng)激指標(biāo)。