何曉茜 唐雪青 劉佳男 吳雪梅 睢明河

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

高尿酸血癥（HUA）的發(fā)病率日益升高嚴重危害著人類健康[1]，而目前上市的降尿酸藥物副作用極大[2-5]。中藥作為HUA常見的調(diào)理方法，有明顯的臨床療效[6-7]，但HUA的調(diào)理是一個長期的過程，很多患者對口服中藥有所排斥，長期服用中藥也不免對患者脾胃及肝腎功能有所影響，故大多數(shù)患者很難長期堅持服藥。針灸亦可有效降低HUA的血尿酸（SUA），并有助于減少腎臟損害[8]，但因治療時間長且頻繁、多數(shù)患者畏針怕疼，需要患者花費較大的治療代價，所以大多數(shù)患者也很難長期堅持針灸。筆者認為穴位敷貼可以有效取代針灸，并將中藥的臨床療效結(jié)合起來，達到事半功倍的效果，且使用起來經(jīng)濟、方便，相對而言治療成本較低，尤其適用于臨床上無癥狀型HUA患者的長期治療，以維持體內(nèi)尿酸的正常水平，但穴位貼敷治療HUA的機制并不明確。經(jīng)查閱資料發(fā)現(xiàn)，約有90%的原發(fā)性HUA的產(chǎn)生主要由于尿酸排泄減少所引起[9]，在排出的尿酸中有2/3是通過腎臟排泄，在腎臟排泄中腎小管的兩次重吸收占有重要地位，其重吸收過程主要通過尿酸轉(zhuǎn)運蛋白URAT1、GLUT9而實現(xiàn)[10-13]。本研究通過氧嗪酸鉀灌胃建立HUA模型，觀察SUA、血肌酐（SCr）的變化，計算并比較各組尿酸排泄指標，觀察HE染色后的腎臟組織病理學(xué)變化，通過免疫組化法確定尿酸重吸收轉(zhuǎn)運蛋白URAT1和GLUT9的表達水平，探討穴位貼敷對HUA模型大鼠腎臟排泄尿酸的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡SPF級雄性SD大鼠，32只，體質(zhì)量（220±20）g，購于北京市維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院動物實驗室。實驗過程中對動物的處置符合北京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物管理條例規(guī)定。

1.2 試藥與儀器

氧嗪酸鉀（Ark Pham：RPX989）；尿酸試劑盒（Beckman：AUZ5947）；肌酐試劑盒（Beckman：AUZ5089）；蘇木素染液、分化液及返藍液（Servicebio：G1004，G1039，G1040）；URAT1一抗（美國abcam：ab155287）；GLUT9一抗（武漢博士德：PB0915）；HRP山羊抗兔二抗（Ser?vicebio：GB23301）；假貼劑：將凡士林制成無藥丸，直徑約0.5 cm，重約0.3 g，并用膠帶固定以制成貼劑。降酸貼：柴胡，芍藥，澤瀉，茯苓，白術(shù)，熟地黃，白芥子（北京同仁堂藥業(yè)有限公司）以1∶1∶1∶1∶1∶2∶2比例混合，干燥后研磨成粉末，與凡士林混合制成直徑約0.5 cm，重約0.3 g的藥丸，并用膠帶固定以制作貼劑。全自動生化分析儀（CX4Pro，美國Beckman），超低溫冰箱（MDF-U50V，日本三洋）；脫水機（JJ-12J，武漢俊杰電子有限公司）；包埋機（JB-P5，武漢俊杰電子有限公司）；病理切片機（RM2016，上海徠卡儀器有限公司）；組織攤片機（KD-P，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；烤箱（DHG-9140A，上?；厶﹥x器制造有限公司）；顯微鏡（XSP-C204，CIC）；Image Pro Plus軟件（美國Media Cybernetics）。

1.3 分組與造模

將32只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用隨機法分為空白組、模型組、假貼敷組和穴位貼敷組，每組8只。除空白組外其余3組大鼠制備HUA模型，造模方法參考文獻[14-15]：按10 mL/kg每天灌胃造模劑氧嗪酸鉀[2 g（/kg·d）]進行造模，連續(xù)灌胃10 d后，改為隔日1次灌胃，直到實驗結(jié)束?？瞻捉M同時灌胃10 mL/kg 0.9%氯化鈉注射液，灌胃時間及用量同其余3組。實驗第10日，氧嗪酸鉀灌胃2 h后大鼠尾靜脈取血，測定其SUA水平，若與空白組比較，其余大鼠的SUA升高，則證明造模成功。

1.4 干預(yù)方法

從造模的第11日開始，空白組正常飲食喂養(yǎng)，不進行干預(yù)。模型組正常飲食，適量抓取，不進行其他干預(yù)。假貼敷組正常飲食，用電推將腹部和背部穴區(qū)去毛備皮，用假貼劑貼敷于大鼠雙側(cè)肝俞和期門、脾俞和章門、腎俞和京門，6 h后去除，每日1次，連續(xù)5次為1個療程，每個療程結(jié)束后休息1 d，一共干預(yù)3個療程，穴位貼敷組干預(yù)方法同假貼敷組，但使用降酸貼進行貼敷，從造模開始后第30 d取材。大鼠取穴參照《實驗針灸學(xué)》：肝俞，脾俞，腎俞，期門，京門，章門[16]。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 血尿生化的測定 在造模的第10日，干預(yù)2 h后，從尾靜脈采血3～5 mL；造模第27日，用代謝籠收集24 h尿液，期間正常飲食，記錄24 h尿液體積（UV），在造模的第28日，大鼠禁食不進水24 h后，用10%的水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射進行麻醉，從腹主動脈中抽血5 mL。血液在靜置1 h后，在4℃下以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心10 min進行分離，并將上清液在-20℃下保存，待測定 SUA、SCr、尿尿酸（UUA）、尿肌酐（UCr）。

1.5.2 尿酸排泄分數(shù)的計算 1）24 h UUA=UV×UUA；2）FEUA%=UUA×SCr（/SUA×UCr）×100%；3）CUr=UV×UUA（/SUA×1440）。

1.5.3 腎臟組織切片觀察 在冰板上取出左腎，并用4%的多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、包埋，切成5～8 μm的切片，80℃烤片1 h，二甲苯、乙醇脫水，蘇木素染色5 min，1%鹽酸酒精溶液分化5～10 s，水洗返藍25 min，5%伊紅染色2 min，乙醇、二甲苯脫水，通過光學(xué)顯微鏡觀察大鼠腎臟組織，包括腎小球、腎小管和腎間質(zhì)的病理變化。

1.5.4 腎臟尿酸重吸收轉(zhuǎn)運蛋白URAT1、GLUT9檢測 將4%多聚甲醛固定的腎臟組織，石蠟切片使用二甲苯和乙醇脫蠟，EDTA抗原修復(fù)緩沖液加熱進行抗原修復(fù)，3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，3%BSA室溫進行血清封閉，加 URAT1一抗（1∶100，PBS稀釋），GLUT9（1∶100，PBS稀釋）（PBS為陰性對照），加入與一抗相應(yīng)的二抗（HRP標記，1∶200稀釋）室溫孵育50 min，加入DAB顯色液，蘇木素復(fù)染3 min，蘇木素返藍液返藍，酒精和二甲苯脫水，風(fēng)干后封片。在顯微鏡下觀察切片，并在顯微鏡下拍攝圖像，各切片取6個互不重疊、不同倍數(shù)的視野。通過Image Pro Plus對免疫組織化學(xué)圖像進行半定量分析，結(jié)果表示為平均光密度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SAS19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。計量資料以（±s）表示，組間差異做兩樣本均數(shù)比較t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠SUA、SCr水平的比較

見表1。在造模的第10日觀察每組大鼠的SUA，與空白組比較，其他3組的SUA水平增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示造模成功。在造模的第28日，與空白組比較，模型組和假貼敷組SUA增加（P＜0.01或P＜0.05）；與模型組及假貼敷組比較，穴位貼敷組SUA降低（P＜0.01）。與空白組比較，模型組大鼠SCr水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與空白組和模型組比較，假貼敷組和穴位貼敷組大鼠SCr水平降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠SUA、SCr水平的比較（μmol/L，±s）

表1 各組大鼠SUA、SCr水平的比較（μmol/L，±s）

與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與假貼敷組比較，□P＜0.05，□□P＜0.01。下同

組別空白組模型組假貼敷組穴位貼敷組n 7 6 7 7 10 d SUA 136.64±66.09 199.28±13.11△△203.50±27.19△△190.01±18.49△△28 d SUA 128.70±44.81 201.69±50.87△△178.62±69.71△91.77±18.78▲▲□□28 d SCr 28.13±4.76 28.63±3.05 23.11±2.80△▲20.43±1.38△▲

2.2 各組大鼠尿酸排泄指標24 h UUA、FEUA、CUr水平的比較

見表2。與空白組比較，其他3組24 h UUA、FEUA、CUr均減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），與模型組和假貼敷組比較，穴位貼敷組24 h UUA、FEUA、CUr水平增加（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)的比較

見圖1?？瞻捉M腎臟結(jié)構(gòu)正常，腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，未有炎癥浸潤、尿酸鹽結(jié)晶。與空白組比較，模型組大鼠腎小球萎縮，腎小管擴張，排列紊亂，管腔內(nèi)可見尿酸結(jié)晶，腎小管上皮細胞明顯腫脹、壞死，空泡變性，包漿出現(xiàn)尿酸結(jié)晶，腎間質(zhì)出現(xiàn)炎性細胞浸潤。模型組和假貼敷組的病理變化相似。與模型組和假貼敷組比較，穴位貼敷組腎小球無明顯萎縮，腎小管管腔擴張減少，管腔內(nèi)偶見尿酸結(jié)晶，偶見腎小管上皮細胞被腫脹、壞死，腎間質(zhì)少有尿酸結(jié)晶、炎細胞浸潤。

表2 各組大鼠尿酸排泄指標24 h UUA、FEUA、CUr水平的比較（μmol/L，±s）

表2 各組大鼠尿酸排泄指標24 h UUA、FEUA、CUr水平的比較（μmol/L，±s）

組別空白組模型組假貼敷組穴位貼敷組n 7 6 7 7 24 h UUA（μmol）12 248.73±5 927.31 829.86±240.42△△549.02±160.18△△2 985.01±460.34△△▲▲□□FEUA（%）4.33±3.14 0.26±0.27△△0.16±0.10△△0.64±0.28△△▲▲□□CUr（mL/min）0.070±0.038 0.003±0.002△△0.002±0.001△△0.023±0.006△△▲▲□□

圖1 腎皮質(zhì)組織的組織學(xué)圖像（免疫組化染色，200倍）

2.4 各組大鼠腎臟尿酸重吸收轉(zhuǎn)運蛋白URAT1和GLUT9水平的比較

見圖2～圖3，表3。免疫組化顯示URAT1表達于腎近曲小管管腔，GLUT9蛋白主要位于腎近曲小管頂膜。蛋白表達強弱可結(jié)合平均光密度半定量分析：空白組腎臟組織URAT1和GLUT9表達較弱，平均光密度低；與空白組比較，模型組和假貼敷組URAT1和GLUT9的表達呈強陽性，平均光密度升高（P＜0.05）；與模型組和假貼敷組比較，穴位貼敷組URAT1和GLUT9的平均光密度降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠尿酸重吸收轉(zhuǎn)運蛋白URAT1和GLUT9表達水平的比較（±s）

表3 各組大鼠尿酸重吸收轉(zhuǎn)運蛋白URAT1和GLUT9表達水平的比較（±s）

組別n URAT1GLUT9空白組模型組假貼敷組穴位貼敷組8 8 8 8 0.126±0.005 0.141±0.007△0.140±0.006△0.128±0.004▲□0.092±0.005 0.128±0.017△0.133±0.020△0.102±0.003▲□

圖2 各組腎臟組織URA1表達（免疫組化染色，400倍）

圖3 各組腎臟組織GLUT9表達（免疫組化染色，400倍）

3 討論

3.1 指標的選取依據(jù)和結(jié)果分析

3.1.1 生化指標（SUA、SCr） SUA是反映人體內(nèi)尿酸代謝正常與否的特異性指標[17]，本研究采用氧嗪酸鉀通過抑制大鼠尿酸分解，減少尿酸排泄，制備HUA模型大鼠模型，造模10 d后，除空白組外，各組大鼠SUA明顯增加，說明造模成功；此后持續(xù)造模，使大鼠在整個實驗過程中維持高尿酸水平。在干預(yù)3個療程后觀察大鼠SUA的變化：與空白組比較，模型組和假貼敷組SUA明顯升高；與模型組和假貼敷組比較，穴位貼敷組SUA明顯降低，說明穴位貼敷可降低HUA模型大鼠的SUA水平。SCr是反應(yīng)腎功能損傷的指標之一[18]。與空白組比較，模型組SCr無明顯變化，說明該造模方法對腎臟功能沒有損害，而假貼敷組和穴位貼敷組大鼠SCr水平降低，說明貼劑的束縛可能減少了大鼠的進食量，使貼敷后的大鼠較空白組和模型組營養(yǎng)降低。

3.1.2 尿酸排泄相關(guān)指標（24hUUA、FEUA、CUr） 腎臟排泄尿酸需經(jīng)過4個過程：尿酸從腎小球濾過100%；在腎小管S1段被重吸收98%～100%；在S2段分泌50%的尿酸到腎小管中；在腎小管S3段再次重吸收40%～44%；最后排出體外的尿酸約有6%～10%?，F(xiàn)已證實，超過90%的原發(fā)性HUA是由腎小管對尿酸的重吸收增加和（或）分泌減少所引起的[19]。有文獻報道，24 h UUA、FEUA、CUr可以反映腎臟排泄尿酸水平[20]。與空白組比較，其他3組24 h UUA、FEUA、CUr減少，說明該HUA模型大鼠的尿酸排泄減少；與模型組和假貼敷組比較，穴位貼敷組24 h UUA、FEUA、CUr升高，說明穴位貼敷促進了尿酸的排泄。

3.1.3 腎臟病理學(xué)檢測 光鏡下觀察腎臟組織病理學(xué)變化，顯示高尿酸水平中的大鼠的腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，出現(xiàn)炎性浸潤，且有尿酸結(jié)晶堆積；而穴位貼敷組的大鼠腎臟組織病變不明顯，少有炎性細胞，且尿酸結(jié)晶較少，表明穴位貼敷可有效清除腎臟組織中積累的尿酸，減輕高尿酸引起的腎臟組織病理改變。

3.1.4 尿酸重吸收轉(zhuǎn)運蛋白的表達（URAT1、GLUT9）URAT1和GLUT9是腎小管中尿酸重吸收的主要轉(zhuǎn)運蛋白，共同參與尿酸重吸收，尿酸從腎小管管腔經(jīng)URAT1轉(zhuǎn)運至腎小管上皮細胞，后經(jīng)GLUT9介導(dǎo)由細胞內(nèi)的尿酸進入到組織液和血液[21]。實驗結(jié)果顯示：URAT1和GLUT9主要表達在腎近曲小管的管腔和頂膜，與空白組比較，模型組和假貼敷組URAT1和GLUT9蛋白表達升高，尿酸重吸收增加，這可能是該模型大鼠SUA升高的原因之一。與模型組和假貼敷組比較，穴位貼敷組URAT1和GLUT9蛋白表達降低，說明穴位貼敷可以降低URAT1及GLUT9的蛋白的高表達，通過減少尿酸的重吸收，使SUA降低。

3.2 降酸貼穴位貼敷的中醫(yī)治療機制

中醫(yī)學(xué)認為HUA與肝、脾、腎密切相關(guān)，為本虛標實證。由先天性稟賦不足或后天失養(yǎng)導(dǎo)致機體腎虛肝郁脾虛，患者正氣不足、氣血運行不暢，水谷精微代謝失常，從而造成痰濁瘀阻在體內(nèi)堆積。

本實驗穴位選用肝俞和期門、脾俞和章門、腎俞和京門，即肝脾腎的俞募穴作為治療穴位：背俞穴指臟腑之氣輸注于背部的一些特定穴位，募穴指臟腑之氣輸注于胸腹部的穴位，臨床常將病變臟腑的俞募配合使用，發(fā)揮協(xié)調(diào)作用，調(diào)節(jié)相關(guān)臟腑功能。降酸貼的成分選用臨床已證實有效的方藥，通過柴胡、芍藥疏肝理氣，熟地黃、澤瀉滋陰補腎，白術(shù)、茯苓健脾利濕；并以白芥子刺激穴位。穴位刺激與藥物傳導(dǎo)相結(jié)合共同發(fā)揮作用，改善HUA模型大鼠肝郁脾虛腎虛的狀態(tài)，排出痰濁瘀阻。

綜上所述，穴位貼敷采用降酸貼作用于肝脾腎的俞募穴可能是通過抑制大鼠腎臟URAT1和GLUT9蛋白的高表達以減少尿酸的重吸收，促進尿酸排泄，發(fā)揮降低SUA的作用；并通過減少尿酸在腎臟的堆積，降低對腎臟的損害。但降酸貼的作用機制是否僅作用于腎臟還需進一步研究。