何玉敏 王進(jìn)燕 何冰杰 王 富 黎小妹 張吉發(fā)

（1.海南省瓊海市人民醫(yī)院，海南 瓊海 571400；2.山東省青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島266200；3.海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心，海南 ?？?571100；4.上海市第六人民醫(yī)院南院，上海 201400）

哮喘是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的一種氣道慢性炎癥性疾病，以可逆性氣道受阻和氣道高反應(yīng)性為主要特點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)上，哮喘屬于“哮證”的范疇，病位在肺，多以邪實為主，常因腑臟功能失調(diào)、情志郁怒、飲食不節(jié)、外邪侵體、氣候改變等原因，導(dǎo)致肺失宣降、痰氣互結(jié)、壅阻氣道、通暢失利、肺氣郁閉，發(fā)為哮喘[1-2]。目前，臨床治療哮喘以糖皮質(zhì)激素聯(lián)合β2受體激動劑為常用藥物，β2受體激動劑直接擴(kuò)張支氣管，糖皮質(zhì)激素則通過強(qiáng)大的抗炎作用抑制氣道重塑，二者合用可發(fā)揮顯著的平喘作用，但糖皮質(zhì)激素長期或大量應(yīng)用可引起多且嚴(yán)重的不良反應(yīng)，甚至?xí)T發(fā)其他疾病，尋求中醫(yī)藥干預(yù)已成為臨床治療哮喘的重要方向。本研究觀察芍藥甘草湯對呼吸道合胞病毒（RSV）誘發(fā)哮喘急性加重模型小鼠細(xì)胞相關(guān)炎癥因子、Bcl-2和Bax表達(dá)及免疫功能的影響，探討芍藥甘草湯對RSV誘發(fā)哮喘急性加重的治療效果及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 50只健康Balb/c小鼠（雌雄不拘），5～6周齡，體質(zhì)量（17±2）g，購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，合格證號：110011191100312。室溫飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，符合《實驗動物管理條例》要求。

1.2 藥物與試劑 芍藥甘草湯組成：芍藥與甘草等量（1∶1），飲片均由瓊海市人民醫(yī)院中藥房提供，藥材加水煎煮2次，合并藥液，生藥含量1 g/mL。地塞米松片（廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號：20190316，規(guī)格：0.75 mg）；卵白蛋白（美國Sigma公司，批號：A6275）；氫氧化鋁凝膠（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號：030M1549）；RSV病毒（武漢華東試驗試劑公司）；水合氯醛（分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）；蘇木精-伊紅染色液（武漢華美生物工程有限公司）；DAB顯色劑（武漢博士德生物公司）；Bcl-2、Bax抗體購自美國 Santa Cruz公司；Envision試劑（HRP/Rabbit）即用型購自丹麥Dako公司；白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-13（IL-13）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）試劑盒、免疫球蛋白E（IgE）試劑盒購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗儀器 RM2235型病理切片機(jī)（德國Li-co公司）；BX60顯微鏡（日本Olympus Optical公司）；LDZ-2型低速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；OLYM?PUSAU5400全自動生化分析儀（日本奧林巴斯有限公司）；402AI型超聲霧化器（上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；ELx800酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.4 分組與造模 小鼠分為空白組10只、手術(shù)組40只，其中手術(shù)組又分模型組、西藥組（地塞米松組）、中藥組（芍藥甘草湯組）、聯(lián)合組（地塞米松+芍藥甘草湯）。參照文獻(xiàn)[3]，除空白組外，其余實驗小鼠分別于第1日和第8日腹腔注射0.5 mL含100 μg卵白蛋白和1 mg氫氧化鋁凝膠的無菌抗原液，使小鼠致敏。致敏后14 d內(nèi)為激發(fā)階段，用1%卵白蛋白生理鹽水溶液5 mL霧化吸入激發(fā)，隔日1次，每次30 min，連續(xù)2周；如小鼠出現(xiàn)精神萎靡、飲食與活動減少、呼吸頻率加快等情況，表示成功，停止激發(fā)。激發(fā)成功后，分別于第22、36、50日用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，以滴度為1.0×106pfu的RSV 5 μL滴鼻，使小鼠感染RSV誘發(fā)哮喘。RSV滴鼻后，如小鼠出現(xiàn)打噴嚏，鼻腔有少量卡他樣無色透明分泌物、弓肩聳背、點(diǎn)頭樣呼吸、腹肌抽搐、甚至站立不穩(wěn)等現(xiàn)象，即為哮喘急性發(fā)作，提示建模成功。空白組用等量生理鹽水代替卵白蛋白進(jìn)行腹腔注射和霧化吸入以及RSV滴鼻。

1.5 給藥方法 建模成功后第2日進(jìn)行干預(yù)?？瞻捉M和模型組給予生理鹽水灌胃，劑量為10 mL/（kg·d）。西藥組給予地塞米松灌胃，1 mg/（kg·d）。中藥組給予芍藥甘草湯灌胃，5 g/（kg·d）。聯(lián)合組給予地塞米松和芍藥甘草湯灌胃，劑量同上。各組每日灌胃1次，連續(xù)治療10 d。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）炎癥因子測定。處死各組小鼠前，心臟取血，離心，取上層血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清IL-6、IL-13、IL-17水平，嚴(yán)格按說明書操作。2）Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)檢測。肺組織常規(guī)病理切片，選取組織標(biāo)本蠟塊進(jìn)行Envision法免疫組化檢測。石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，PBS漂洗3次，3 min/次；滴加 0.3%H2O2，室溫靜置 15～20 min，PBS漂洗3次；滴加20%正常山羊血清封閉液，室溫孵育30 min；滴加一抗，Bcl-2和Bax按照一定濃度稀釋，室溫孵育10～15 min，4℃過夜，37℃復(fù)溫30 min，PBS漂洗3次，5 min/次；滴加Envision試劑（HRP/R），37℃孵育30 min，PBS洗3次，5 min/次。DAB顯色8～12 min；蘇木素復(fù)染，熱水藍(lán)化；脫水，透明，樹脂封片；烤片，拍照。Bcl-2和Bax蛋白染色呈棕黃色或黃色，在高倍鏡下每張切片隨機(jī)選取3個視野，計算支氣管壁和肺組織Bcl-2和Bax陽性面積百分比，取平均值作為最終結(jié)果。3）免疫球蛋白IgE含量測定。處死各組小鼠前，心臟取血，離心，取上層血清，采用ELISA法測定各組小鼠血清IgE水平，嚴(yán)格按說明書操作。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗完成計量資料比較；采用χ2檢驗進(jìn)行計數(shù)資料的比較，以n（%）表示計數(shù)資料。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肺組織病理學(xué)比較 見圖1。空白組支氣管管腔光滑，上皮完整，氣道黏膜無水腫，肺泡間隔正常，氣道及肺泡偶見嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。模型組支氣管管腔變形、狹窄，氣道周圍血管擴(kuò)張充血，可見大量淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增厚，氣道平滑肌增生變厚。西藥組支氣管管腔正常，上皮基本完整，氣道黏膜無明顯水腫，肺泡間隔基本正常，氣道壁無明顯嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。中藥組支氣管管腔基本正常，氣道黏膜輕度水腫，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤顯著降低。聯(lián)合組僅少量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。

圖1 各組小鼠肺組織病理學(xué)比較（HE染色，200倍）

2.2 各組小鼠炎癥因子水平比較 見表1。與空白組相比，模型組IL-6、IL-13、IL-17水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組小鼠IL-6、IL-13、IL-17水平均顯著降低（P＜0.05）；與西藥組比較，中藥組小鼠IL-6、IL-13、IL-17水平明顯偏高（P＜0.05）；西藥組與聯(lián)合組小鼠IL-6、IL-13、IL-17水平無明顯差異（P＞0.05）。

表1 各組小鼠炎癥因子水平比較（ng/L，±s）

表1 各組小鼠炎癥因子水平比較（ng/L，±s）

與對照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與西藥組比較，▲P＜0.05。下同

組別n IL-6IL-13IL-17空白組模型組西藥組中藥組聯(lián)合組10 10 10 10 10 7.14±0.86 22.31±1.78*12.59±1.25*△17.14±1.66*△▲13.37±1.12*△10.78±1.64 30.47±6.28*16.83±5.96*21.12±8.05*△▲18.07±6.39*△18.40±1.91 43.52±5.48*20.36±4.35*△28.96±4.74*△▲22.27±3.56*△

2.3 各組小鼠Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較 見表2，圖2～圖3?？瞻捉M小鼠肺組織及氣道Bcl-2的陽性面積比率最低、Bax的陽性面積比率最高。與空白組比較，模型組小鼠肺組織及氣道Bcl-2陽性面積明顯增高、Bax陽性面積明顯降低（P＜0.05）。與模型組相比，各治療組小鼠的肺組織及氣道Bcl-2陽性面積均顯著降低、Bax陽性面積均顯著升高（P＜0.05）；與西藥組比較，中藥組小鼠肺組織及氣道Bcl-2陽性面積明顯偏高、Bax陽性面積明顯偏低（P＜0.05）；西藥組與聯(lián)合組小鼠肺組織及氣道Bcl-2陽性面積、Bax陽性面積相比無顯著差異（P＞0.05）。

表2 各組小鼠Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（%，±s）

表2 各組小鼠Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)比較（%，±s）

組別空白組模型組西藥組中藥組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10 Bcl-2陽性面積百分比10.41±2.03 54.52±8.28*20.86±6.42*△34.18±7.35*△▲22.77±6.86*△Bax陽性面積百分比48.14±8.87 14.64±3.36*39.32±7.23*△29.29±6.45*△▲36.27±7.02*△

圖2 各組小鼠肺組織Bcl-2蛋白表達(dá)（DAB染色，200倍）

圖3 各組小鼠肺組織Bax蛋白表達(dá)（DAB染色，200倍）

2.4 各組小鼠IgE含量比較 見表3。與空白組相比，模型組IgE水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組小鼠IgE水平均顯著降低（P＜0.05）；與西藥組比較，中藥組小鼠IgE水平明顯偏高（P＜0.05）；西藥組與聯(lián)合組小鼠IgE水平無明顯差異（P＞0.05）。

表3 各組小鼠IgE含量比較（U/mL，±s）

表3 各組小鼠IgE含量比較（U/mL，±s）

組別空白組模型組西藥組中藥組聯(lián)合組n 10 10 10 10 10 IgE 14.82±1.31 92.73±5.46*22.32±2.38*△35.94±3.22*△▲24.94±2.22*△

3 討 論

哮喘的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全明確，氣道炎癥認(rèn)為是重要的發(fā)病機(jī)制之一[4-5]。當(dāng)敏感個體被過敏原刺激時會發(fā)生異常免疫應(yīng)答，激活T淋巴細(xì)胞增殖分化為Th2細(xì)胞，而Th1/Th2失衡與Th17細(xì)胞大量增多是哮喘氣道炎癥的重要機(jī)制[6]。Th2、Th17細(xì)胞能產(chǎn)生多種炎癥因子如 IL-4、IL-6、IL-13、IL-17、TNF-α等。其中IL-6是Th17細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵因子[7]，IL-17具有強(qiáng)大的致炎作用；IL-13是Th2細(xì)胞分泌的多效能細(xì)胞因子，可不依賴于IL-4、IgE及嗜酸性粒細(xì)胞等傳統(tǒng)途徑而誘發(fā)哮喘[8]。在多種細(xì)胞因子的作用下，炎癥細(xì)胞進(jìn)一步激活，炎癥因子分泌增加，同時可介導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞趨化，誘發(fā)哮喘急性加重[9]。Th2細(xì)胞釋放炎癥因子的同時使B細(xì)胞增殖加速，并誘導(dǎo)其產(chǎn)生的抗體類型轉(zhuǎn)向IgE[10]。lgE可引起Ⅰ型超敏反應(yīng)，水平升高會加重哮喘氣道炎癥反應(yīng)，誘發(fā)多種炎癥因子大量釋放，使哮喘急性加重。因此，降低IL-6、IL-13、IL-17和IgE水平對減輕氣道炎癥，緩解哮喘急性發(fā)作有重要治療意義。

嗜酸性粒細(xì)胞是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞之一，其炎性浸潤與哮喘變應(yīng)性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[11]。當(dāng)RSV感染后，病變部位的嗜酸粒細(xì)胞數(shù)目明顯增多，多種免疫細(xì)胞被激活并趨化，使哮喘急性加重，因此加快嗜酸性粒細(xì)胞凋亡，對消除氣道炎癥、緩解哮喘發(fā)作有重要意義[12]。細(xì)胞凋亡受多種基因調(diào)控，Bcl-2和Bax被認(rèn)為是關(guān)鍵基因，其中Bcl-2為抑制凋亡基因，Bax是促凋亡基因。Bcl-2可通過抑制誘導(dǎo)因子被激活，抑制細(xì)胞凋亡[13]；Bax是 Bcl-2的拮抗蛋白，通過拮抗Bcl-2的功能促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bcl-2過高時，抑制生物體內(nèi)細(xì)胞凋亡；反之，Bax升高促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。因此維持Bcl-2和Bax平衡對調(diào)控細(xì)胞凋亡有重要意義。

中醫(yī)認(rèn)為哮喘屬于“哮證”，其病機(jī)主要為宿痰內(nèi)伏于肺，復(fù)以外因誘發(fā)，以致痰隨氣升，氣因痰阻，痰氣互結(jié)，壅阻氣道，肺氣上逆。芍藥甘草湯最早出自漢代張仲景的《傷寒雜病論》，由芍藥和甘草兩味中藥等量組成，取其止咳、平喘功效，用于治療哮喘、支氣管炎等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實[15-16]，芍藥甘草湯可解痙、鎮(zhèn)痛，能有效抑制卵白蛋白致敏支氣管哮喘小鼠的各類炎性細(xì)胞增生，抑制氣道重構(gòu)，產(chǎn)生良好的平喘作用。芍藥總苷是芍藥的主要有效成分，具有雙向抗炎免疫調(diào)節(jié)作用；而甘草的有效成分甘草次酸則具有明顯的皮質(zhì)激素樣作用，可通過抑制IgE和組胺的生物合成產(chǎn)生抗炎、抗過敏作用；二者合用可協(xié)同發(fā)揮作用。

本研究結(jié)果顯示，西藥組與聯(lián)合組小鼠各項指標(biāo)比較均無明顯差異。與空白組相比，模型組IL-6、IL-13、IL-17、IgE水平顯著升高；與模型組比較，各治療組小鼠IL-6、IL-13、IL-17、IgE水平均顯著降低；與西藥組比較，中藥組小鼠IL-6、IL-13、IL-17、IgE水平明顯偏高。與空白組比較，模型組小鼠肺組織及氣道Bcl-2陽性面積明顯增高、Bax陽性面積明顯降低；與模型組相比，各治療組小鼠的肺組織及氣道Bcl-2陽性面積均顯著降低、Bax陽性面積均顯著升高；與西藥組比較，中藥組小鼠肺組織及氣道Bcl-2陽性面積明顯偏高、Bax陽性面積明顯偏低。表明芍藥甘草湯能有效減輕氣道炎癥，阻止氣道重塑，對RSV誘發(fā)哮喘急性加重有良好的治療作用。

綜上所述，芍藥甘草湯可降低RSV誘發(fā)哮喘急性加重模型小鼠的IL-6、IL-13、IL-17等炎癥因子水平，減輕氣道炎癥反應(yīng)；提升Bax、降低Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)嗜酸粒細(xì)胞凋亡；降低LgE水平，提升免疫功能，對RSV誘發(fā)哮喘急性加重有良好的治療作用。