李竹英 高風麗 李寒梅

（黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

哮喘是一種發(fā)病原因和機制比較復雜的異質(zhì)性疾病，其發(fā)生發(fā)展與機體免疫失衡密切相關(guān)[1]。抗原遞呈細胞（APC）是啟動哮喘氣道免疫反應的關(guān)鍵，而樹突細胞是目前已知功能最強的專職性APC，最大特點是能夠顯著刺激輔助性T細胞增殖和分化。輔助性T細胞的分化方向決定著哮喘特征性的病理生理過程[2-3]。平喘顆粒是黑龍江中醫(yī)藥大學自制的中藥制劑，前期臨床研究顯示平喘顆粒對改善哮喘患者的臨床癥狀，提高患者的FEV1、PEF水平具有較好療效，但其具體機制尚不清楚[4-5]。本研究通過觀察平喘顆粒對哮喘大鼠肺組織樹突細胞表面因子的影響，探討其作用機制，為臨床研究提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠，40只雌雄各半，由延邊大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（吉）-2011-0007，體質(zhì)量（200±20）g，室溫17～25 ℃，相對濕度45%～65%。

1.2 試藥與儀器 平喘顆粒，組成：淫羊藿200 g，太子參 150 g，黃芪 150 g，五味子150 g，知母100 g，炙麻黃100 g，款冬花（炙）150 g，地龍100 g，罌粟殼40 g。上藥加水煎煮2次，每2小時過濾1次，通過醇沉方式[6]濃縮成稠膏，相對密度為1.20～1.25（60 ℃），由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院將其制備成1 000 g干燥顆粒，灌胃前用溫水稀釋成1.08 g/mL含藥溶液。卵蛋白（OVA），美國 Sigma公司；氯喹，美國 Sigma-Al?drich；Anti-CD86抗體[EP1158Y]，英國abcam；Anti-CD80 antibody（PE），英國abcam；PE－Cy5－MHCⅡ抗體，英國abcam。Lx81研究級倒置熒光顯微鏡，日本Olymps公司；SW-CJ-2FD/標準配置超凈工作臺，上海博迅；Facscaliber流式細胞儀，美國BD公司；超薄切片機，上海五相儀器儀表廠。

1.3 分組與造模 40只Wistar大鼠隨機分為4組，每組10只，分別是空白組、哮喘組、自噬抑制劑組、平喘顆粒組?？瞻捉M以生理鹽水代替OVA激發(fā)，其他組應用OVA致敏液[10 mg OVA+100 mg Al（OH）3凝膠的無菌抗原液]激發(fā)，制備慢性哮喘大鼠模型。于實驗第0、12日給予大鼠腹腔注射10%OVA致敏液1 mL致敏，之后將致敏液濃度改為5%，每天激發(fā)30 min，激發(fā)5 d后改為隔1 d激發(fā)1次，連續(xù)激發(fā)6周。

1.4 給藥方法 空白組、哮喘組給予生理鹽水灌胃（5 mL/kg），自噬抑制劑組在第2次致敏后第4天開始給予60 μg/g氯喹腹腔注射，激發(fā)階段則每次激發(fā)前1 h給予氯喹腹腔注射；平喘顆粒組給予中藥藥液5 mL/kg灌胃，時間同自噬抑制劑組。

1.5 標本采集與檢測 各組大鼠末次激發(fā)24 h后處死，開胸取固定的肺組織行石蠟包埋、切片，將病理切片行HE染色，光鏡下觀察肺組織炎性浸潤情況。采用免疫組化（OX-62標記）檢測肺組織DCs浸潤情況。同時取大鼠右肺的前葉及中葉部分，經(jīng)PBS過濾、漂洗后，加入分選磁柱中，通過PBE沖洗收集DCs。將各組獲取的DCs重懸于300 μL預冷的PBS中，以備流式細胞儀檢測。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)以（±s）表示，兩兩比較用獨立樣本t檢驗，組間比較用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織光鏡下結(jié)果 空白組大鼠肺組織及支氣管結(jié)構(gòu)基本上處于正常狀態(tài)，肺泡輪廓清晰。哮喘組大鼠肺組織及支氣管外周可見大量的炎性細胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)異常。自噬抑制劑組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔大小均一，組織中及支氣管外周可見炎性細胞浸潤灶。平喘顆粒組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡輪廓清晰，組織中及支氣管外周可見多個中等大小的炎性細胞浸潤灶。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理觀察（HE染色，200倍）

2.2 各組大鼠肺組織DCs浸潤情況比較 見表1，圖2。大鼠哮喘模型造模成功后，肺組織DCs浸潤數(shù)量增多，與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。給予自噬抑制劑和平喘顆粒治療后，肺組織DCs浸潤數(shù)量減少，與哮喘組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但自噬抑制劑組與平喘顆粒組之間無顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠肺組織DCs浸潤情況比較（±s）

表1 各組大鼠肺組織DCs浸潤情況比較（±s）

與空白組比較，?P＜0.05；與哮喘組比較，△P＜0.05。下同

組別空白組哮喘組自噬抑制劑組平喘顆粒組n 10 10 10 10 DCs浸潤數(shù)量（個）14.26±1.43 53.63±3.76*34.40±1.00*△34.62±2.93*△

圖2 各組肺組織DCs浸潤光鏡下觀察（OX-62蛋白免疫組化，200倍）

2.3 各組大鼠DCs CD80、CD86及MHCⅡ表達比較見表2。造成大鼠哮喘模型后，DCs表面各因子表達增高，與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。給予自噬抑制劑和平喘顆粒治療后，DCs表面各因子表達下降，與哮喘組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但自噬抑制劑組與平喘顆粒組之間無顯著差異（P＞0.05）。

表2 各組大鼠CD80、CD86及MHCⅡ表達比較（%，±s）

表2 各組大鼠CD80、CD86及MHCⅡ表達比較（%，±s）

組別空白組哮喘組自噬抑制劑組平喘顆粒組n 10 10 10 10 CD80 31.98±1.84 81.86±4.11*61.10±2.07*△61.56±2.62*△CD86 38.18±1.26 72.67±2.63*53.06±2.99*△55.17±2.47*△MHCⅡ34.54±1.20 75.08±2.14*59.59±2.40*△57.62±2.63*△

3 討論

DCs是哮喘發(fā)生和發(fā)展中的一種關(guān)鍵免疫細胞，一方面在機體受到外界細菌、病毒和變應原刺激時，可在肺組織和刺激部位呈現(xiàn)聚集狀態(tài)，將抗原傳遞給局部淋巴結(jié)的T細胞區(qū)；另一方面，DCs可促進T細胞向Th2極化，引起Th1/Th2平衡失調(diào)，進而導致哮喘的發(fā)生[7-9]。研究發(fā)現(xiàn)通過抑制樹突細胞TIM4水平，抑制Th2細胞的表達，調(diào)控Th1/Th2向Th1極化，可以減輕哮喘小鼠的氣道炎癥反應[10]?？梢?，DCs可通過參與哮喘的炎性反應過程和誘導免疫耐受兩方面，成為治療哮喘的潛在靶點。不同成熟階段的DCs抗原遞呈能力有所差異，未成熟的DCs（iDCs）通常不激活T細胞，當機體受到抗原刺激時，DCs被活化成熟，遷移到淋巴結(jié)的T細胞區(qū)發(fā)揮抗原遞呈作用，此時DCs表面的共刺激分子CD80、CD86和MCHⅡ分子呈高表達狀態(tài)[11-12]。DCs在成熟過程中細胞表面表達的共刺激分子CD80和CD86與T細胞表面表達的CD28分子相互作用，共同促進T細胞向Th2分化，誘導哮喘發(fā)作[13-14]。MHCⅡ作為DCs表面的抗原提呈分子，與外源性抗原結(jié)合成復合物形式提呈給CD4+T細胞，從而成為T細胞活化的第一啟動信號[15-16]。平喘顆粒由淫羊藿、太子參、黃芪、五味子、知母、炙麻黃、款冬花、罌粟殼、地龍組成。方中淫羊藿、炙麻黃共為君藥，具有溫補腎陽，宣肺平喘之功；黃芪、太子參、五味子、款冬花、地龍共為臣藥，具有益氣助陽，潤肺生津，止咳平喘之功；罌粟殼斂肺止咳，為方中之佐藥；知母潤肺止咳，引方中諸藥歸經(jīng)，為方中之使藥。諸藥合用使腎陽得補，脾氣得健，肺氣得以宣暢，共奏溫陽益氣，化痰平喘之效。流式結(jié)果顯示，經(jīng)OVA激發(fā)后，與空白組相比，其余各組大鼠肺組織DCs表面CD80、CD86、MHCⅡ的表達均升高。其中在平喘顆粒組和自噬抑制劑組中，上述因子的表達均較哮喘組降低，而兩組之間比較差異無統(tǒng)計學意義。綜上所述，平喘顆?？梢愿纳葡笫蠓谓M織中的炎癥反應及DCs浸潤情況，從而抑制哮喘的發(fā)生，其機制可能與本方降低DCs表面CD80、CD86、MHCⅡ的表達有關(guān)。本研究對平喘顆粒治療哮喘的作用機制做了進一步的探討，但中藥治療疾病的機制往往是多元化的，未來我們?nèi)孕枰罅康难芯咳リU釋更深、更廣的作用機制。