鄭燕飛 郭 瑩

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053）

虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）為蓼科植物虎杖的干燥根及根莖，味微苦、藥性平，歸肝、膽、肺經(jīng)，虎杖藥用歷史悠久，入藥始見于《雷公炮炙論》[1]?；⒄溶眨≒olydatin，PD）是從虎杖的干燥根莖中提取的單體，它是虎杖的重要生物活性成分之一[2]?，F(xiàn)代研究表明，虎杖具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗血栓、抗氧化等多種藥理作用[3]。本實驗采用乙醇提取虎杖中的虎杖苷，在單因素試驗基礎(chǔ)上考察影響虎杖苷得率的主要提取因素，通過響應(yīng)面法優(yōu)化虎杖苷的提取工藝，并對虎杖提取物進行體外抗氧化和抑菌活性評估，以期為虎杖中活性成分的進一步研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FA2104N電子分析天平：上海菁海儀器有限公司；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RE-5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；Spectra Max M3酶標儀：美國MD公司；超凈工作臺：SW-CT-2G型，凈化儀器有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌鍋：YXQ-LH-18SI型，北京迅博儀器有限公司；恒溫培養(yǎng)箱：SBX-250B-Z型，博迅醫(yī)療設(shè)備有限公司。

1.2 材料

虎杖：浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片有限公司，批號180301；虎杖苷對照品：上海源葉生物科技有限公司，批號ZM0530LA14，純度7.18%；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌（浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院發(fā)酵工程實驗室提供）；LB培養(yǎng)基為實驗室自制，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 虎杖苷含有量測定

2.1.1 供試品溶液制備[4]精密稱取虎杖粗粉4.0 g（過50目篩），采用乙醇回流法于不同因素下提取，趁熱過濾，濾液旋蒸后加入甲醇溶劑定容至50 mL，紫外分光光度計于305 nm處檢測其吸光值。

2.1.2 標準曲線制備 精密稱取虎杖苷對照品3.0 mg，定容至50 mL，充分混勻，得到0.06 mg/mL的原液，稀釋成不同質(zhì)量濃度，測量得到標準曲線：Y=0.0747X+0.0877，R2=0.9995，在1.5～24 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗[5]

2.2.1 乙醇體積分數(shù) 取虎杖粉末4.0 g，固定提取時間1 h，液料比10 mL/g，溫度為60℃，分別加入50%、60%、70%、80%、90%、95%乙醇，測定虎杖苷含有量，結(jié)果可知，乙醇體積分數(shù)在50%～95%時，溶液中虎杖苷含有量基本保持不變，在70%時達到最大值，隨后有所下降至基本不變。

2.2.2 提取溫度 取虎杖粉末4.0 g，固定提取時間1 h，液料比10 mL/g，乙醇體積分數(shù)60%，分別于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃水浴中提取，測定虎杖苷含有量，結(jié)果可知，在50～90℃時，隨溫度的升高，溶液中虎杖苷含有量有所增加，直至溫度升高至70℃后基本保持不變。

2.2.3 料液比 取虎杖粉末4.0 g，固定提取時間1 h，乙醇體積分數(shù)60%，提取溫度為60℃，料液比分別為5、10、15、20、25 mL/g提取，測定虎杖苷含有量，結(jié)果可知，溶液中虎杖苷含有量隨著乙醇量的增加表現(xiàn)為先增加后減小，其中在液料比為15 mL/g時達到最大值。

2.2.4 提取時間 取虎杖粉末4.0 g，固定乙醇體積分數(shù)60%，提取溫度為60℃，料液比1∶10，提取時間為0.5、1、1.5、2、2.5 h，測定虎杖苷含有量，結(jié)果可知，溶液中虎杖苷含有量隨著提取時間的增加略微有所增加，隨后有所下降至基本不變。

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面法

由單因素試驗可知提取溫度（因素A）、時間（因素B）、料液比（因素C）這3個因素對虎杖苷的提取得率影響較大，因此選用這3個因素進行工藝的優(yōu)化，在乙醇體積分數(shù)為60%的條件下，以虎杖苷含有量（Y）為評價指標，設(shè)計三因素三水平試驗，采用Design-Expert軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析[5]，由Y=0.0747X+0.0877方程計算出虎杖苷含有量。因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素水平表

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計結(jié)果

表3 方差分析

通過Design-Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行分析，得到方程Y=+44.99-0.059A-1.05B+2.08C+2.58AB+0.19AC-1.53BC-2.97A2-2.77B2-3.42C2，方差分析見表3，由表可知，模型P＜0.0001，差異極顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義；失擬項P＞0.05，表明模型擬合度良好；B、C、AB、BC、A2、B2、C2差異顯著（P＜0.05），其他項不顯著（P＞0.05），各因素影響程度依次為C>B>A。

響應(yīng)面分析見圖1～圖3，由圖可知，溫度與液料比的響應(yīng)面的曲面較陡，表明其交互作用對虎杖苷含有量的影響顯著，而與提取時間、液料比與溫度的響應(yīng)面的曲線較平滑，表明其交互作用對虎杖苷含有量的影響較小，可知液料比和提取溫度之間交互作用有明顯影響。

圖1 溫度與時間對虎杖苷含有量影響的響應(yīng)面圖（a）與等高線圖（b）

圖2 液料比與時間對虎杖苷含有量影響的響應(yīng)面圖（a）與等高線圖（b）

圖3 液料比與溫度對虎杖苷含有量影響的響應(yīng)面圖（a）與等高線圖（b）

2.4 最優(yōu)提取工藝

通過Design-Expert軟件分析得最佳提取工藝為：提取溫度77.54℃、提取時間1.54 h、液料比16.53 mL/g以及乙醇濃度60%。

2.5 虎杖提取物體外抗氧化活性實驗[6]

精密移取20 mg/mL虎杖提取物，分別稀釋至8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 mg/mL，取各提取液20 μL于96孔板中，加入180 μL 0.1 g/mL DPPH溶液，以60%乙醇作空白對照，Vit c作陽性對照，避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測量吸光度，并計算清除率。重復(fù)實驗3次，結(jié)果如圖4所示?？芍⒄忍崛∥镔|(zhì)量濃度在0.125～4 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增大，當(dāng)質(zhì)量濃度達到4 mg/mL后，對DPPH自由基的清除率基本保持不變，可達90%。

圖4 不同質(zhì)量濃度虎杖提取物DPPH清除率實驗結(jié)果

2.6 虎杖提取物體外抑菌活性實驗

2.6.1 最小抑菌濃度（MIC）測定 參照文獻[7]方法。采用二倍比稀釋法將虎杖提取物稀釋成系列梯度濃度，取10 μL菌液（約1×107cfu/mL）均勻涂布在90 mm LB瓊脂培養(yǎng)基上，每板放置牛津杯，各孔加入100 μL的藥液，以青霉素鈉作陽性對照，60%乙醇為空白對照，37℃恒溫培養(yǎng)18 h，觀察測量抑菌圈直徑，并判斷MIC，完全沒有抑菌直徑的最低藥物質(zhì)量濃度即為MIC。多次實驗結(jié)果取平均值，結(jié)果見表4、圖5。由圖可知，優(yōu)化工藝下得到的虎杖提取物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有抑制作用，隨著虎杖提取物質(zhì)量濃度的提高抑菌圈直徑逐漸增大，且金黃色葡萄球菌的抑菌圈大于枯草芽孢桿菌，對大腸桿菌抑制效果不明顯。

表4 不同質(zhì)量濃度虎杖提取物對細菌的抑制作用（mm，±s）

表4 不同質(zhì)量濃度虎杖提取物對細菌的抑制作用（mm，±s）

菌種陰性對照金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌大腸桿菌n 3 3 3 MIC（mg/mL）15.625 15.625-虎杖提取物（mg/mL）500 17.47±1.38 15.83±0.56-250 17.25±1.13 15.54±0.65-125 15.38±1.63 14.13±1.51-陽性對照37.31±1.59 37.14±0.42 15.81±1.93- - -

圖5 虎杖提取液對細菌的抑制作用

2.6.2 細菌生長抑制量-時曲線 參照文獻[8]方法。在含2MIC、MIC、1/2MIC的含藥培養(yǎng)基中接種1%（體積分數(shù)）對數(shù)期菌液，以不含藥的相應(yīng)培養(yǎng)基接種1%（體積分數(shù)）對數(shù)期菌液作為空白對照，37℃，180 r/min搖床培養(yǎng)。4 h后，每隔1小時測菌液吸光度；以時間（h）為橫坐標，波長600 nm處菌液吸光度，A600nm為縱坐標繪制細菌生長曲線，結(jié)果見圖6。由圖可知，對照組中的兩個菌株表現(xiàn)出典型的正常細菌生長曲線，不同質(zhì)量濃度虎杖提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌生長表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，但兩種菌的總體生長周期并無明顯變化，其中2MIC虎杖提取液對兩種菌株的生長有明顯的抑制作用，使其無法進入對數(shù)生長期，生長曲線趨于平緩。

圖6 不同質(zhì)量濃度虎杖提取物對細菌生長曲線的影響

3 討論

虎杖是一味傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、活血化瘀的功效，主要成分包括二苯乙烯類、蒽醌類、黃酮類、酚類等，虎杖苷是白藜蘆醇與葡萄糖結(jié)合的產(chǎn)物，也稱為白藜蘆醇苷，具有良好的穩(wěn)定性，其藥理作用與白藜蘆醇類似，兩者可在體內(nèi)相互轉(zhuǎn)化[9]。本實驗通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到虎杖苷最佳回流提取條件：溫度77.54℃，乙醇體積分數(shù)60%，液料比16.53 mL/g，提取時間1.54 h。單因素實驗結(jié)果顯示，乙醇濃度過高，溶液中虎杖苷含有量并未增加，這可能由于乙醇濃度過高使植物細胞失水，有效成分不易擴散，從而降低虎杖苷的提取率[10]；同時液料比過高或過低都不利于虎杖苷的提取，可能通過影響虎杖細胞的移動和虎杖苷從細胞中釋放，使溶解度下降，降低虎杖苷的得率[11]。

在抗氧化實驗中，虎杖提取物表現(xiàn)出良好的抗氧化能力，當(dāng)質(zhì)量濃度為4 mg/mL時，對DPPH的清除率可達到90%，與其他中藥相比，具有明顯優(yōu)勢[12]。近期研究表明[13]，虎杖苷在腦缺血、動脈粥樣硬化、非酒精性脂肪肝等疾病的治療中發(fā)揮一定作用，具有減輕機體脂質(zhì)過氧化、降低氧化損傷的作用。虎杖苷具有3個酚羥基，也提示其具有抗氧化活性，可通過進一步分析虎杖提取物中的組分探究其發(fā)揮抗氧化作用的主要活性物質(zhì)，為相關(guān)疾病的治療提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

在抑菌實驗中，虎杖提取物對金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有一定抑制作用，并呈劑量依賴性，對大腸桿菌的抑制作用不明顯。金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，兩者屬于常見的致病菌，大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，屬于條件致病菌。研究表明，虎杖中的虎杖苷、大黃素等具有抗菌活性，其可通過抑制細菌神經(jīng)氨酸酶活性，阻斷細菌細胞壁、細胞膜的形成，破壞膜的完整性從而抑制細菌的生長[14-15]。虎杖提取物對于大腸桿菌并不敏感，這可能與革蘭氏陰性菌表面多層結(jié)構(gòu)的細胞壁有關(guān)，阻礙了藥物通過外膜到達作用靶點，也可能與提取物未進一步純化有關(guān)。細菌生長抑制曲線是動態(tài)衡量抗菌藥物抗菌活性的定量指標，可以反映抗菌藥物作用于細菌不同時間后細菌的生長情況。結(jié)果顯示虎杖提取物在MIC和2 MIC條件下，分別對兩種菌株的生長有不同的抑制作用，其可能通過破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)或功能影響細菌的正常代謝活性和生理功能，阻斷細菌進入對數(shù)期所需核酸和蛋白質(zhì)的合成，從而抑制其生長[16]。

中藥具有成分復(fù)雜、作用靶點多等特點，且毒副作用相對小，虎杖中含有多種活性成分，藥理作用廣泛，其多組分之間是否存在協(xié)同起效的可能，虎杖提取物中發(fā)揮抗氧化作用的主要有效成分是什么，抑菌的具體作用機制如何，藥物進入體內(nèi)發(fā)揮藥理作用效果是否與體外一致，有待進一步研究。