劉建和 毛宗裕 肖冰凌 袁恒佑 楊成龍 趙吉銳

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學中醫(yī)診斷學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410007；3.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208）

根據(jù)《中國心血管病報告2018》，隨著經(jīng)濟發(fā)展，生活質量及飲食水平提高，中國心血管疾病發(fā)病率及死亡率不斷增長，防治心血管疾病十分迫切[1]。各種類型的心肌缺血均可引起心律失常，而鈣離子（Ca2+）的轉運障礙是其發(fā)病的重要機制之一。缺血性心律失常與心肌細胞凋亡相互影響，心肌出現(xiàn)損傷，可能機制為鈣超載、氧化應激。已了解心肌細胞凋亡與心血管疾病的發(fā)病機制相關[2-3]，Bcl-2及Fas是心肌凋亡中重要的基因。本研究旨在運用依據(jù)“和解定悸法”所研制的柴胡三參膠囊，與維拉帕米及參松養(yǎng)心膠囊做對照[4-5]，觀察柴胡三參膠囊對缺血性心律失常大鼠模型心肌細胞Bcl-2蛋白及Fas蛋白的影響[6-7]，探索柴胡三參膠囊抗心肌凋亡的作用，完善其治療缺血性心律失常的可能機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8周齡的Wistar大鼠60只，SPF級，雄性，體質量（200±20）g。動物購自長沙天勤，許可證號為SCXK（湘）2014-0011，實驗動物質量合格證號No.43006700015330。動物均在實驗前置于實驗室適應環(huán)境3 d，在清潔及安靜環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，每籠5只。喂養(yǎng)飼料購自湖南中醫(yī)藥大學東塘實驗動物中心。室溫控制在（23±3）℃。將60只大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分成6組，為假手術組、模型組、柴胡三參膠囊組、參松養(yǎng)心膠囊組、維拉帕米組、空白組，每組10只。

1.2 藥物與試劑

1）藥物。柴胡三參膠囊（組成為柴胡、黃芩、法半夏、黨參、丹參、苦參、青蒿、甘草，為醫(yī)院自制劑，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑科提供，批號140403。規(guī)格每粒0.4 g）；參松養(yǎng)心膠囊（北京以嶺藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號Z20103032；規(guī)格每粒0.4 g）；維拉帕米片劑（天津市中央藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號H12020051；規(guī)格每片0.04 g）。柴胡三參膠囊、參松養(yǎng)心、維拉帕米均以70 kg成人劑量0.069 g/（kg·d）換算，將膠囊溶水后制成灌胃液。2）試劑。10%水合氯醛（上海展云，貨號180920）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（bioswamp，貨號PAB180007）；RIPA（強）組織細胞快速裂解液（bioswamp，貨號 PAB180006）；蛋白質Marker（Thermo，貨號26634）；RNA保存液（北京華越洋，貨號ZH0103-A）；ProteinG Magnetic Beads（CellSig?naling，貨號 9006S）；過硫酸銨（自 Sigma，貨 號A6761）；Tween-20（Amresco，貨號 P-1379）；十二烷基硫酸鈉（SDS）（Sigma，貨號151-21-3）；TEMED（Sigma，貨號 110-18-9）；PBS磷酸鹽緩沖液（bio?swamp，貨號PAB180003）；PVDF轉移膜（millipore，貨號IPVH00010）；化學發(fā)光試劑（millipore，貨號 WB?KLS0010）。Western blotting溶液配制：（1）PBS溶液：在 600 mL的 ddH2O 中溶解 NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、Na2HPO41.44 g和 KH2PO40.24 g，用 HCl將 pH 調至7.4，定容至1 L，過濾后高壓滅菌，室溫封存。（2）1 mol/L二硫蘇糖醇（DTT）：將3.09 g DTT溶于20.0 mL 0.01 mol/L pH5.2的乙酸鈉中，經(jīng)過濾及除菌后分為1.0 mL/份，于-20℃保存。（3）30%丙烯酰胺：29.0 g丙烯酰胺和1.0 g甲叉雙丙烯酰胺配以70 mL ddH2O攪拌加熱溶解后，定容至100 mL，4℃避光存放。（4）10%過硫酸銨：0.5 g過硫酸銨溶于5 mL ddH2O中，4℃保存。（5）1.5 mol/L Tris-HCl（pH8.8）：Trisbase 36.33 g 溶于ddH2O中，用濃鹽酸調pH值至8.8，定容至200 mL。（6）1.0 mol/L Tris-HCl（pH6.8）：Trisbase 24.22 g 溶于ddH2O中，用濃鹽酸調pH值至6.8，定容至200 mL。（7）1×Tris-甘氨酸電泳緩沖液：Trisbase 3.03 g，甘氨酸14.4 g，10%SDS 10 mL，于ddH2O中溶解，定容至1 L。（8）2×SDS加樣緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0），100 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）2%SDS，0.016%溴酚藍，及20%甘油。（9）電轉緩沖液：甘氨酸14.4 g，Tris?base 3.0 g，甲醇200 mL，加ddH2O定容至1 L。（10）TBS（pH8.0）：在 95 mL ddH2O 中加入 Tris-base 1.21 g，NaCl 8.77 g，溶解并調pH至8.0后，定容至1 L。（11）PBST：含0.05%Tween-20的 PBS。（12）封閉液：含 5%脫脂奶的PBST。

1.3 實驗儀器

電泳儀（BIO-RAD，型號miniprotean3cell）；酶標儀（芬蘭雷勃，型號MK3）；干式恒溫器（杭州爽盛，型號K30）；離心機（德國Eppendorf，型號Centrifuge5424R）；微量移液槍（美國RaininPiPet-Lite）；全自動化學發(fā)光分析儀（上海天能，型號Tanon-5200）；水浴鍋（Leica，型號HI1210）；UPT優(yōu)普特實驗室超純水器[法國Mil?liPORE，型號ULUPURE]。

1.4 分組與造模

1）分組。將60只大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為6組：假手術組、模型組、柴胡三參膠囊組、參松養(yǎng)心膠囊組、維拉帕米組、空白組，每組10只。2）造模方法。用藥物干預后進行造模。造模前禁食12 h，末次給藥后30 min后進行造模，用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉老鼠，固定于手術臺，切開氣管行氣管插管，連接呼吸機，以大頭針皮下接RM-6280生物信號采集系統(tǒng)（德國產(chǎn)），穩(wěn)定5～10 min后記錄一段正常心電圖。于胸骨左緣縱行切開皮膚，切口長度約2 cm，逐層手術剪分離組織，剪斷肋間肌肉，暴露出心臟，左心耳下進針，肺動脈旁出針，硅膠管結扎冠狀動脈左前降支，關閉胸腔，立即觀察ECG。以Ⅱ導聯(lián)ST段明顯抬高或T波高聳，結扎處心臟表面顏色變暗為造模成功的標準。結扎30 min后再灌注40 min，觀察灌注后ECG的變化，再灌注成功的標志為ST段回落或T波下降，缺血區(qū)顏色轉紅。假手術組則不結扎硅膠管。

1.5 干預方法

干預2周，假手術組、模型組、空白組給予蒸餾水灌胃，灌胃容積為1 mL/100 g，其余實驗組按分組藥物灌胃。柴胡三參膠囊組：以70 kg成人劑量0.069 g/（kg·d）換算，劑量為0.432 g/（kg·d）。參松養(yǎng)心膠囊組：同柴胡三參膠囊組。維拉帕米組：換算后維拉帕米溶液0.022 g/（kg·d）。觀察結束后處死老鼠，取下缺血心肌組織（大小約5 mm×5 mm）立刻放入裝內RNA保存液的獨立錐形試管中，做好標記，密閉封存于-80℃的冰箱中。

1.6 觀察指標

1）心律失常指標：采用Curtis和Walker（1988）心律失常評分法對心律失常嚴重程度進行比較[8]。用RM-6280生物信號采集系統(tǒng)監(jiān)測心電，記錄Ⅱ導聯(lián)，記錄心律失常的發(fā)生例數(shù)及計算心律失常積分。2）Western blotting檢測大鼠心肌細胞的Bcl-2蛋白及Fas蛋白表達變化。按照每20mg組織配150～250 μL裂解液的比例充分裂解，裂解后的樣品在4℃，12 000g離心15 min，取上清液，完成蛋白質定量后封存于-80℃冰箱。在酶標板中加入蛋白標準液及去離子水，繪制標準曲線，根據(jù)樣品的吸光值，可在標準曲線上獲得相應的蛋白質量濃度（μg/μL），乘以樣品稀釋倍數(shù)（10）等于樣品實際質量濃度（μg/μL）。備好SDSPAGE膠上樣，每孔上樣量為20 μg蛋白左右，電泳選一般濃縮膠80 V，40 min，分離膠120 V，50 min，適當調整電壓和時間，當染料到達膠底部時停止電泳。選用濕轉轉膜行封閉及抗體孵育，一抗孵育過夜，二抗1︰10 000孵育過夜，運用ECL化學發(fā)光檢測后全自動化學發(fā)光分析儀檢測膜，TANONGIS軟件讀取各條帶灰度值。β-actin作為內參對照。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況比較

各組大鼠前期灌胃階段無自然死亡。造模階段因手術創(chuàng)傷、未發(fā)現(xiàn)再灌注、出現(xiàn)惡性心律失常等，假手術組死亡2只，維拉帕米組死亡2只，其中室顫死亡1只，柴胡三參膠囊組室顫死亡1只，模型組室顫死亡4只，死亡共9只，采集51份標本。

2.2 各組大鼠心電圖變化

2.2.1 各組大鼠心電圖表現(xiàn) 見表1。惡性心律失常死亡大鼠進入心律失常評分統(tǒng)計，通過RM-6280生物信號采集系統(tǒng)采集有效大鼠心電圖57份。根據(jù)Cur?tis-Walker心律失常評分標準進行計算：正常心電圖0分，房性心律失常1分，室性早搏2分，室性心動過速3分，室顫4分。

表1 各組大鼠心電圖匯總統(tǒng)計表（n）

2.2.2 各組大鼠心律失常平均積分比較 見表2。與空白組比較，假手術組心律失常發(fā)生率增加，但差異無明顯統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在心肌缺血后的心律失常的發(fā)生率極高，模型組心律失常積分明顯升高（P＜0.05），提示缺血性心律失常模型造模成功。與模型組比較，3個藥物干預組心律失常評分下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示藥物干預有效。與柴胡三參膠囊組對比，參松養(yǎng)心膠囊組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），維拉帕米組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示柴胡三參膠囊、參松養(yǎng)心膠囊干預抗缺血性心律失常效果優(yōu)于維拉帕米。

2.3 各組大鼠心肌細胞中Bcl-2蛋白表達比較

表2 各組大鼠心律失常平均積分比較（分，±s）

表2 各組大鼠心律失常平均積分比較（分，±s）

與空白組比較，※P＜0.05；與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01。與柴胡三參膠囊組比較，▲P＜0.05。下同

組 別n 心律失常積分柴胡三參膠囊組參松養(yǎng)心膠囊組維拉帕米組模型組假手術組空白組10 10 9 10 8 10 1.70±0.67★1.70±0.82★*2.11±1.05★▲3.20±0.79※0.50±0.76 0.00±0.00

見表3。各藥物干預組與模型組進行比較，模型組大鼠心肌細胞Bcl-2蛋白表達水平相對降低，維拉帕米組Bcl-2蛋白升高相對較明顯，柴胡三參膠囊組及參松養(yǎng)心膠囊組均可上調心肌凋亡蛋白Bcl-2的表達，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。柴胡三參膠囊組、參松養(yǎng)心膠囊組、維拉帕米組3個藥物干預組組間進行對比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.4 各組大鼠心肌細胞中Fas蛋白表達比較

表3 各組大鼠缺血心肌細胞中Bcl-2蛋白表達的比較（±s）

表3 各組大鼠缺血心肌細胞中Bcl-2蛋白表達的比較（±s）

組別柴胡三參膠囊組參松養(yǎng)心膠囊組維拉帕米組模型組假手術組空白組n 10 10 9 10 8 10 Bcl-2蛋白表達0.53±0.11★★0.54±0.11★★0.58±0.10★★0.32±0.13 0.68±0.14 0.72±0.12

見表4。取平均灰度值，模型組大鼠心肌細胞Fas的表達升高。與模型組比較，柴胡三參膠囊組、參松養(yǎng)心膠囊組、維拉帕米組Fas的表達水平均不同程度降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。柴胡三參膠囊組、參松養(yǎng)心膠囊組之間差異不明顯（P＞0.05）。

綜上，模型組Bcl-2蛋白下降而Fas蛋白升高，提示缺血性心律失常后出現(xiàn)心肌凋亡，柴胡三參膠囊組、參松養(yǎng)心膠囊組、維拉帕米組均可上調Bcl-2蛋白表達，下調Fas蛋白，均可抗缺血性心律失常心肌凋亡，三者減少心肌損傷的效果無明顯差異。

表4 各組大鼠心肌細胞中Fas蛋白表達的比較（±s）

表4 各組大鼠心肌細胞中Fas蛋白表達的比較（±s）

組別柴胡三參膠囊組參松養(yǎng)心膠囊組維拉帕米組模型組假手術組空白組n 9 1 0 8 6 8 1 0 Fas蛋白表達0.43±0.07▲0.42±0.09▲0.35±0.07▲▲0.51±0.10 0.23±0.08 0.15±0.06

圖1 各組Bcl-2及Fas蛋白表達條帶

3 討論

心律失常是心肌缺血的并發(fā)癥，包括室早、室速和室顫等惡性心律失常，是心肌梗死患者早期死亡的主要原因[8]。柴胡三參膠囊以“和解”之法組方，來源于和解定悸之柴胡三參湯，是基于小柴胡湯的方藥，主要以和解少陽為基礎，從寒溫并用，疏達上下，通利三焦，交通內外，調理氣機等多方面調和，體現(xiàn)“緩治致和”的精神。通過柴胡、黃芩、法半夏、黨參、丹參、苦參、青蒿、甘草8味藥，祛除痰熱瘀結諸邪，兼顧扶補正氣，得益氣活血、清熱化痰、和解定悸之功，原柴胡三參湯中藥有常山，因常山有毒，改用青蒿，是治療缺血性心律失常的有效驗方[9-11]。

維拉帕米、參松養(yǎng)心膠囊是臨床治療心律失常的常用藥物。維拉帕米作為鈣離子拮抗劑，治療缺血后心律失常作用確切，經(jīng)實驗證實可通過直接或間接上調Bcl-2表達保護心肌，改善心肌凋亡[12]。參松養(yǎng)心膠囊主要成分為人參、麥冬、山茱萸肉、丹參、酸棗仁（炒）、桑寄生、赤芍、土鱉蟲、甘松、黃連、南五味子、龍骨，可益氣養(yǎng)陰、活血通絡、清心安神，用于治療冠心病室性早搏屬氣陰兩虛、心絡瘀阻證型。參松養(yǎng)心膠囊也被實驗證實用于大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，可減輕心律失常的程度，且有抗心肌凋亡的作用，故選為陽性對照組[13]，在實驗中采用2周的藥物療程以達到穩(wěn)定濃度獲得干預效果。

缺血性心律失常涉及多種機制，是心肌組織缺血、缺氧后，誘導觸發(fā)灶和致心律失?；|共同作用，心肌電生理異常而發(fā)生，可出現(xiàn)在再灌注之前或期間。細胞凋亡是細胞死亡的一種重要形式，它是由基因調控的、在一定條件及信號轉導下程序性的主動細胞死亡過程。線粒體通路是細胞凋亡的主要通路，Bcl-2蛋白參與其中，可進行上游調控，抑制凋亡蛋白酶Caspases激活，維持膜通路穩(wěn)定。Fas家族主要是細胞外源性凋亡蛋白，稱為死亡受體，以跨膜轉導凋亡信號，F(xiàn)as及Fas配體結合誘導細胞凋亡[14]，與Bcl家族共存，兩種蛋白共同參與心肌凋亡發(fā)展過程，提示抗凋亡作用及促凋亡作用的交爭狀態(tài)。細胞凋亡與心血管疾病的關系密切，各種細胞凋亡因子存在于心肌細胞中有著正向和負向的作用，參與了心肌缺血、心律失常、肥厚型心肌病、心力衰竭等眾多心血管病的發(fā)生發(fā)展過程[15]。

心肌凋亡與缺血性心律失常相互影響，心肌再灌注損傷中，心肌凋亡時間越久，缺血面積越大，心律失常發(fā)生率越高。當長時間缺血的心肌細胞再灌注，氧自由基產(chǎn)生，炎性細胞浸潤，血管內皮受損，心肌電活動不穩(wěn)定，心肌細胞L型鈣通道電流升高，Ca2+內流，細胞內Ca2+濃度增加，發(fā)生鈣超載，心肌細胞過度凋亡，抑制凋亡因子Bcl-2蛋白及刺激凋亡因子Fas蛋白表達水平相應變化，觸發(fā)缺血性心律失常，在早期運用藥物減少心肌細胞凋亡及缺血性心律失常的發(fā)生對于指導臨床有一定意義。

現(xiàn)代中醫(yī)藥關于抗心肌細胞凋亡的研究頗多[16]，多種藥物被證實對心肌凋亡過程中各通道有著不同作用。柴胡三參膠囊抗心律失常作用明確，但作用機制尚未不明確，此次選用心肌凋亡經(jīng)典蛋白Bcl-2及Fas蛋白作為切入點觀察柴胡三參膠囊抗心肌凋亡的作用，可為臨床治療用藥提供更加有力的支持及解釋。通過實驗可知，柴胡三參膠囊能上調抑制凋亡因子Bcl-2的表達及下調促進凋亡因子Fas的表達，從不同渠道減輕心肌細胞凋亡，緩解心肌細胞損傷，保護心肌細胞，從細胞層面改善缺血性心律失常。