梁剛 王智翔 何盟國(guó) 楊學(xué)超 郭棟△

(1.陜西核工業(yè)二一五醫(yī)院 普通外科;2.病理科， 陜西 咸陽(yáng) 712000)

神經(jīng)導(dǎo)向因子Slit是一種分泌性糖蛋白，可通過(guò)結(jié)合神經(jīng)細(xì)胞膜上的Roundabout(Robo)受體家族發(fā)揮生物學(xué)功能?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)Slit/Robo信號(hào)通路除了能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元軸突(或胞體)遷移外，還參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[1,2]。膽囊癌是膽道系統(tǒng)的惡性腫瘤，有關(guān)Slit/Robo信號(hào)通路在膽囊癌發(fā)生發(fā)展中的作用報(bào)道甚少，本研究通過(guò)測(cè)定Slit2蛋白在膽囊癌組織中的表達(dá)情況，分析Slit2蛋白與膽囊癌患者臨床特征及預(yù)后之間的關(guān)系，以期了解Slit /Robo信號(hào)通路對(duì)膽囊癌發(fā)展的作用。報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1一般資料 選取陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院 2008年1月至2015年12月間行膽囊癌手術(shù)治療的石蠟包埋標(biāo)本80例，其中男性34例， 女性46例， 平均年齡(62±3.25)歲，臨床分期參照第八版外科學(xué)教材(2014年)膽囊癌 TNM 分期：Ⅰ期 14例、Ⅱ期 26例、Ⅲ期 35例、Ⅳ期 5 例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者 38 例；組織學(xué)類(lèi)型分類(lèi):腺癌 68例， 鱗癌 12 例。所有病例術(shù)前均未接受化放療，術(shù)后經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為膽囊癌。另取80例相應(yīng)癌旁組織作為對(duì)照組，癌旁組織均取自距腫瘤邊緣 2 cm 以上無(wú)腫瘤組織。

1.2主要試劑 兔抗人Slit2多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德公司， SABC即用型免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)由武漢博士德公司提供。

1.3方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)方法 采用免疫組織化學(xué)法，切取80例膽囊癌組織及癌旁組織石蠟標(biāo)本，切片厚度4 μm，將石蠟切片脫蠟至水化；3% H2O2去離子水室溫孵10 min；PBS沖洗(5 min × 3次)；微波修復(fù)(0.01 mol/L枸櫞酸鹽，pH 6.0) 20 min；PBS沖洗(5 min × 3次)；5%BSA封閉液37 ℃孵育30 min，甩干；滴加一抗 4 ℃過(guò)夜(Slit2 濃度為1∶50)；PBS沖洗(5 min × 3次)；滴加生物素標(biāo)記的二抗；PBS沖洗(5 min × 3次)；滴加SABC液；PBS沖洗(5 min × 3次)；DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片，每批實(shí)驗(yàn)以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3.2Slit2蛋白結(jié)果判斷 陽(yáng)性染色為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒狀，Slit2染色評(píng)估是根據(jù)每張切片陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)進(jìn)行分級(jí)。染色強(qiáng)度分4級(jí)：不著色為與背景一致，記為0分；弱染色為淡黃色略高于背景，記為1分；中度染色為黃色，明顯高于背景，記為2分；強(qiáng)染色為棕褐色，記為3分。陽(yáng)性細(xì)胞面積同樣分4級(jí)：0%～11%記0分、11%～26%記1分、26%～51%記2分、51%～100%記3分。兩項(xiàng)指標(biāo)分?jǐn)?shù)相加，總積分為0～2為陰性，3分及以上為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3.3生存隨訪 通過(guò)患者住院記錄在案的電話(huà)進(jìn)行隨訪，生存時(shí)間以手術(shù)時(shí)間為起點(diǎn)， 2018年12月31日為隨訪時(shí)間終點(diǎn)，共隨訪 68例，失訪12例。隨訪患者最短生存時(shí)間2月，最長(zhǎng)生存時(shí)間85月。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1膽囊癌組織及癌旁組織中Slit2的蛋白表達(dá)情況 膽囊癌組織中Slit2陽(yáng)性表達(dá)率為57.5%，癌旁組織中Slit2陽(yáng)性表達(dá)率為35.0%。兩者均表現(xiàn)為細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)黃色顆?；驁F(tuán)塊，見(jiàn)圖1、圖2；與癌旁組織相比，Slit2蛋白的表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.457，P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 Slit2在膽囊癌組織中陽(yáng)性表達(dá) ×100

圖2 Slit2在癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá) ×100

表1 膽囊癌及癌旁組織中Slit2蛋白表達(dá)情況(n)

2.2Slit2蛋白表達(dá)水平與膽囊癌患者臨床病理特征的關(guān)系 膽囊癌TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的Slit2蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05) ；患者年齡、性別、膽囊癌病理類(lèi)型、有無(wú)膽囊結(jié)石等特征與Slit2蛋白水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05) 。見(jiàn)表2。

表2 Slit2蛋白表達(dá)水平與膽囊癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.3Slit2蛋白表達(dá)水平與膽囊癌患者預(yù)后的關(guān)系 生存分析顯示：Slit2陽(yáng)性表達(dá)組及Slit2陰性表達(dá)組的膽囊癌患者術(shù)后 3 年生存率分別為 45.5%和64.3%，兩組的中位生存時(shí)間分別為：12.0個(gè)月和30.0個(gè)月，Slit2陽(yáng)性表達(dá)組的患者總生存期明顯低于陰性表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.229，P=0.022)。

圖3 Slit2蛋白陽(yáng)性表達(dá)組及陰性表達(dá)組的生存曲線(xiàn)

3 討 論

Slit蛋白家族是由基因 4p15.2 編碼的大分子量的細(xì)胞外分泌蛋白，有Slit1、Slit2、Slit3 3個(gè)成員，通過(guò)結(jié)合跨膜蛋白R(shí)obo受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。目前研究發(fā)現(xiàn)，在Slit/Robo信號(hào)通路中，配體Slit蛋白主要通過(guò)其結(jié)構(gòu)內(nèi)富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeat,LRR)結(jié)合受體Robo胞外前兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域樣功能區(qū)(lg1、lg2)樣功能區(qū)，激活Robo受體胞內(nèi)區(qū)域，使其與下游效應(yīng)物質(zhì)如：小Rho GTPases等相互作用，發(fā)揮復(fù)雜的生物學(xué)功能[3,4,5]，如神經(jīng)軸突導(dǎo)向、白細(xì)胞趨化性反應(yīng)[6]、心管的形成[7]、腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8,9,10]、血管損傷及生成[11,12,13]]等。

目前研究發(fā)現(xiàn)Slits在多種腫瘤中表達(dá)升高，有學(xué)者[14]報(bào)道Slit2在鱗狀胃癌、肝癌、惡性黑色素瘤、直腸粘液腺瘤等常見(jiàn)腫瘤中有表達(dá)。Slit2在惡性黑色素瘤系A(chǔ)375細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，而受體Robo1表達(dá)于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上，有學(xué)者推測(cè)Slit2/ Robo1信號(hào)通路參與了惡性黑色素瘤的發(fā)病。Slit2、Robo1蛋白在分化狀態(tài)差的晚期肝癌細(xì)胞上表達(dá)上調(diào)，通過(guò)測(cè)量Slit2、Robo1的表達(dá)情況可預(yù)測(cè)腫瘤分期和分化狀態(tài)[15]。Slit2、Robo1在小腸癌中過(guò)度表達(dá)，激活Slit2/Robo1信號(hào)通路可誘導(dǎo)小腸粘膜癌變，并通過(guò)活化Src信號(hào)，下調(diào)E黏連蛋白，進(jìn)而激活Wnt/β-catnin 途徑，促進(jìn)小腸腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]。在一些腫瘤中，Slit2在表達(dá)上沒(méi)有明顯變化，而其受體Robo1在直腸癌細(xì)胞中表達(dá)水平明顯上調(diào)[17]。近年來(lái)，關(guān)于Slit/Robo信號(hào)通路與惡性腫瘤關(guān)系的研究越來(lái)越受人們重視，但Slit/Robo信號(hào)通路與膽囊癌的研究在國(guó)內(nèi)外報(bào)道較少。

本研究發(fā)現(xiàn)，Slit2 蛋白主要分布于細(xì)胞胞質(zhì)，并且高表達(dá)于膽囊癌組織中，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示膽囊癌中可能存在Slit/Robo信號(hào)通路，并且該通路對(duì)膽囊癌的發(fā)生發(fā)展有一定作用。另外，Slit2蛋白在TNM分期較晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膽囊癌組織中表達(dá)升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示Slit/Robo信號(hào)通路可能參與了膽囊癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。通過(guò)生存分析發(fā)現(xiàn)Slit2陽(yáng)性表達(dá)組患者生存期明顯低于Slit2陰性表達(dá)組患者，提示Slit/Robo信號(hào)通路可能與膽囊癌患者的生存期密切相關(guān)。Y.Shao等[18]研究發(fā)現(xiàn)膽囊癌中Slit、Robo1在表達(dá)升高，Slit表達(dá)與膽石癥和肝臟受累有關(guān)，Robo1表達(dá)與肝臟受累和病理分期有關(guān)，并且Slit表達(dá)是Robo1表達(dá)的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，盡管我們的研究與Shao等部分結(jié)果不一致，但都說(shuō)明了Slit/Robo信號(hào)通路可能對(duì)膽囊癌的發(fā)生發(fā)展有一定作用。

綜上所述，Slit2蛋白與膽囊癌侵襲、轉(zhuǎn)移及與預(yù)后密切相關(guān)，Slit2蛋白可能通過(guò)Slit/Robo信號(hào)通路參與了上述生物學(xué)行為，其具體作用及機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入研究。