牛玥，朱敏，劉芃巖，秦占芬,*

1. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100085 2. 河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，保定 071002 3. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

雙酚A(bisphenol A, BPA)是全球大量生產(chǎn)的化學(xué)品之一，主要用于生產(chǎn)聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂[1]。動物和人類通過多種途徑暴露于這種化學(xué)物質(zhì)[2]。動物試驗(yàn)研究表明，BPA在生物體生殖、發(fā)育和神經(jīng)功能等方面具有毒性效應(yīng)[3-5]，近幾年的流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)也表明，BPA與人類某些疾病相關(guān)[6]，所以，一些國家和政府開始限制BPA的使用范圍。相應(yīng)地，BPA類似物開始作為BPA的替代品被投入生產(chǎn)和使用，如雙酚F(bisphenol F, BPF)、雙酚S(bisphenol S, BPS)、雙酚AF(bisphenol AF, BPAF)等。BPA替代品在多種環(huán)境介質(zhì)、生物樣品乃至人體樣品中都有檢出[7-9]，因此，BPA替代品的安全性受到越來越廣泛的關(guān)注。

BPA替代品與BPA的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似[10]，可能存在與BPA類似的效應(yīng)，已有文獻(xiàn)報道BPF、BPS有與BPA類似的激素活性[11]，可產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應(yīng)[12]。資料顯示，BPA對大鼠、小鼠和兔的經(jīng)口暴露半致死劑量(LD50)分別為240、3 250和2 230 mg·kg-1[13-14]；BPF對大鼠的經(jīng)口暴露LD50為4 950 mg·kg-1[13-14]。李圓圓等[15]發(fā)現(xiàn)，BPA和BPF對黑斑蛙蝌蚪的半致死濃度(LC50)分別為9.00和9.52 mg·L-1；任文娟等[16]報道了BPA、BPF和BPAF對斑馬魚的LC50分別為8.09、9.51和2.47 mg·L-1。當(dāng)生物體暴露于化學(xué)品時，生物體為保護(hù)自身免受損傷而做出一系列的應(yīng)激響應(yīng)[17]，如氧化應(yīng)激與熱休克反應(yīng)。在生物體內(nèi)谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase, GR)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(glutathione transferase, GST)和硫氧還蛋白(thioredoxin, Trx)等是氧化應(yīng)激的良好指標(biāo)[18]。熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是生物體在不良環(huán)境因素作用下所產(chǎn)生的一組特殊的蛋白質(zhì)，能維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)應(yīng)對環(huán)境變化，從而起到分子伴侶的作用。HSPs基因一般主要分為hsp90、hsp70、hsp60和小hsp共4個家族。氧化應(yīng)激與熱休克反應(yīng)是應(yīng)激響應(yīng)的主要組分，是生態(tài)毒理學(xué)中用來評價化學(xué)品毒性的常用指標(biāo)[18]。許多體外和動物試驗(yàn)表明，BPA可以誘導(dǎo)生物體釋放活性氧產(chǎn)生氧化應(yīng)激[18-19]。Jain等[20]研究發(fā)現(xiàn)，BPA暴露導(dǎo)致大鼠體內(nèi)活性氧水平升高，產(chǎn)生氧化應(yīng)激。還有研究表明，BPA不但能夠改變秀麗隱桿線蟲幼蟲中GST活性，還能夠改變蝸牛體內(nèi)hsp70和hsp90的表達(dá)[17,21]。流行病學(xué)研究表明，人體尿液中BPA的濃度與氧化應(yīng)激水平相關(guān)[22-24]。

本文選用兩棲動物非洲爪蛙作為實(shí)驗(yàn)材料，通過研究LC50、氧化應(yīng)激和熱休克蛋白相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平，比較BPA及替代品對非洲爪蛙的急性毒性以及其引起的蛙體的應(yīng)激響應(yīng)，從而進(jìn)一步分析BPA及替代品的生態(tài)風(fēng)險，同時為BPA及替代品的毒性研究提供有效數(shù)據(jù)。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的非洲爪蛙的成年雌蛙和雄蛙，分養(yǎng)于盛有去氯自來水的玻璃缸中，水溫(22±2) ℃，明暗光周期為12 h∶12 h。成蛙喂食1∶1配比的豬肝和商品飼料，喂食2 h后換水，每周2次。

非洲爪蛙雌蛙皮下注射300～500 IU促黃體素釋放激素(LHRH)和人絨毛膜促性腺激素(HCG)，雄蛙注射200～300 IU的上述激素。將雌雄蛙放于產(chǎn)卵容器中，置于黑暗、安靜的環(huán)境中讓其抱對，12 h左右即可產(chǎn)卵。受精卵在(22±1) ℃的去氯自來水中孵化，胚胎發(fā)育至48期的蝌蚪，進(jìn)行暴露試驗(yàn)。

1.2 試劑與儀器

儀器和設(shè)備：高速冰凍離心機(jī)(5810/5810R，Eppendorf，德國)；PCR儀( MiniAmp，Applied Biosystem，美國)；熒光定量PCR儀(MX3500P，Strata gene，美國)；組織碾磨儀(MM301，Retsch，德國)；渦旋混勻器(VORTEX 2，WIGGENS，美國)；全自動核酸提取儀(AU1001，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；電子天平(JA2003B，上海越平科技儀器有限公司)；移液器(Eppendorf，德國)；全自動凝膠成像儀(GBOX-HR，Syn Gene，英國)；普通PCR儀(My Cycler TM，BIO-RAD，美國)；電泳儀(DYCP-31F，北京六一儀器廠)。

試劑：BPA(CAS No. 80-05-7，純度97%，ACROS Organics，分子量228.29)；BPF(CAS No. 620-92-8，純度>99%，東京化成工業(yè)，分子量200.24)；BPAF(CAS No. 1478-61-1，純度99%，北京百靈威科技有限公司，分子量336.23)；二甲基亞砜(DMSO，CAS No. 67-68-5，純度≥99.5%，Sigma-Aldrich，美國)；核酸染料(G-red)和RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Fast Quant RT Kit和RT-qPCR試劑盒Super Real Pre Mix Plus(SYBR Green)kit(天根生化科技有限公司，北京)；PCR引物(華大基因，北京)。

1.3 非洲爪蛙蝌蚪急性毒性試驗(yàn)

BPA、BPF和BPAF用助溶劑DMSO配成100 g·L-1的儲備液。設(shè)置溶劑對照組，其中溶劑的濃度與最高濃度處理組溶劑濃度相同，溶劑的體積濃度不超過0.01%。暴露實(shí)驗(yàn)在玻璃缸內(nèi)進(jìn)行，每個缸盛有1 L暴露液，蝌蚪隨機(jī)放入10尾。每隔24 h換一次水，清除死亡個體，記錄死亡數(shù)，實(shí)驗(yàn)持續(xù)48 h。

在正式實(shí)驗(yàn)之前先對3種化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行較大濃度范圍(0.1、1、10、100和1 000 mg·L-1)的預(yù)試驗(yàn)，不設(shè)平行組，各濃度的缸中加入10尾蝌蚪，觀察記錄48 h蝌蚪死亡數(shù)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)得出的結(jié)果，設(shè)置正式試驗(yàn)濃度。正式試驗(yàn)以1.2為公比設(shè)置5個濃度梯度(表1)和溶劑對照組，每組3個平行，每個缸中隨機(jī)加入10尾蝌蚪。其他同預(yù)實(shí)驗(yàn)，重復(fù)2次正式試驗(yàn)。

表1 雙酚A(BPA)、雙酚F(BPF)和雙酚AF(BPAF)的濃度設(shè)置Table 1 Concentration of bisphenol A (BPA), bisphenol F (BPF) and bisphenol AF (BPAF)

1.4 RNA提取和RT-qPCR

每個缸隨機(jī)取2尾蝌蚪，全自動核酸提取儀提取RNA，超微量分光光度計測定RNA濃度，用瓊脂糖凝膠電泳來確定RNA完整性。然后根據(jù)Fast Quant RT Kit(with g DNase)說明書配制20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

根據(jù)SYBR Green PCR Kit說明，配制10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行RT-qPCR。PCR程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性15 min，40個循環(huán)擴(kuò)增(95 ℃變性10 s、退火20 s、72 ℃延伸20 s)。每個基因在使用之前都進(jìn)行了擴(kuò)增效率的驗(yàn)證，計算公式為E=(10-1/slope-1)×100。擴(kuò)增效率在90%～110%之間、溶解曲線單一且重合、不存在非特異性擴(kuò)增的基因時，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行基因表達(dá)分析時，以rpl8為管家基因?qū)Ω鱾€基因的表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化[25]?；虻南鄬Ρ磉_(dá)量根據(jù)公式2-ΔΔCT計算[26]。引物及相關(guān)信息如表2所示。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計單元為缸，即n值等于平行缸數(shù)[27]。重復(fù)2次正式試驗(yàn)，得到相似的結(jié)果，在文中只呈現(xiàn)其中一次的試驗(yàn)數(shù)據(jù)[28]?；貧w分析使用Probit，建立“劑量-效應(yīng)”線性方程，并計算LC50值及其95%置信區(qū)間。統(tǒng)計數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(standard error of mean, SEM)表示。暴露組與各自的對照相比，顯著性差異采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，P值<0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 非洲爪蛙蝌蚪急性毒性試驗(yàn)

溶劑對照組中非洲爪蛙蝌蚪無死亡，試驗(yàn)質(zhì)量控制良好。BPA、BPF和BPAF暴露組蝌蚪均有不同程度的死亡(圖1)。24 h時，4.82 mg·L-1BPA、7.23 mg·L-1BPF和1.93 mg·L-1BPAF暴露組的蝌蚪存活率分別為93.33%、83.33%和100%，10.00 mg·L-1BPA暴露組蝌蚪的存活率為20%，15.00 mg·L-1BPF和4.00 mg·L-1BPAF暴露組蝌蚪的存活率相同，均為0%。48 h時，5.79 mg·L-1的BPA暴露組中蝌蚪的存活率由24 h的76.67%下降到73.33%，12.50 mg·L-1的BPF暴露組的蝌蚪存活率與24 h時相比下降了16.67%，其他濃度暴露組的蝌蚪存活率不變。觀察蝌蚪死亡現(xiàn)象時發(fā)現(xiàn)，15.00 mg·L-1BPF暴露組實(shí)驗(yàn)開始不久，蝌蚪沉到水底，很快死亡，其他濃度BPF暴露組的部分蝌蚪也出現(xiàn)了上述現(xiàn)象，并清楚看到存活蝌蚪的腮充血，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，存活蝌蚪心臟的血液回流緩慢甚至堵塞。暴露于4.00 mg·L-1BPAF的蝌蚪，先是快速沒有規(guī)律地游動，同時皮膚迅速發(fā)白，很快死亡，這種現(xiàn)象隨暴露組濃度的降低而消失。10.00 mg·L-1BPA暴露組的蝌蚪，行動遲緩，最終死亡，其他濃度BPA暴露組的部分蝌蚪也出現(xiàn)該現(xiàn)象，暴露組濃度越低該現(xiàn)象越不明顯。

經(jīng)統(tǒng)計分析得到BPA、BPF和BPAF對蝌蚪的24 h-LC50分別為7.59、11.58和2.87 mg·L-1；48 h-LC50分別為7.54、11.01和2.87 mg·L-1(表3)。毒性強(qiáng)弱順序?yàn)锽PAF>BPA>BPF。

圖1 BPA、BPF和BPAF暴露后非洲爪蛙蝌蚪的存活率Fig. 1 Survival rates of Xenopus laevis tadpoles after exposure to BPA, BPF and BPAF

表2 RT-qPCR引物及相關(guān)信息Table 2 Primers sequences and relevant information for RT-qPCR

表3 BPA、BPF和BPAF對非洲爪蛙蝌蚪的LC50及其95%置信區(qū)間和回歸方程Table 3 LC50, 95% confidence interval and regression equations of BPA, BPF and BPAF to Xenopus laevis tadpoles

注：LC50及其95%置信區(qū)間的單位為mg·L-1。

Note: The unit of LC50and its 95% confidence interval is mg·L-1.

2.2 BPA及替代品對非洲爪蛙蝌蚪體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

RT-qPCR結(jié)果表明(圖2)，暴露48 h后，4.82～10.00 mg·L-1的BPA和7.23～12.50 mg·L-1的BPF顯著上調(diào)蝌蚪體內(nèi)gr、gst和trx這3種基因的轉(zhuǎn)錄水平，呈線性劑量-效應(yīng)關(guān)系。8.68 mg·L-1BPF暴露組蝌蚪體內(nèi)gst的相對表達(dá)量遠(yuǎn)高于8.33 mg·L-1BPA暴露組。8.68 mg·L-1BPF暴露組蝌蚪體內(nèi)gr和trx的表達(dá)量與8.33 mg·L-1BPA暴露組類似。4.82～10.00 mg·L-1的BPA顯著下調(diào)蝌蚪體內(nèi)gpx的轉(zhuǎn)錄水平，7.23～8.68 mg·L-1的BPF與4.82～10.00 mg·L-1的BPA類似，但12.50 mg·L-1的BPF顯著上調(diào)gpx的轉(zhuǎn)錄水平，呈現(xiàn)高濃度促進(jìn)低濃度抑制的趨勢。BPAF暴露組蝌蚪體內(nèi)gst和gr基因的相對表達(dá)量與BPAF暴露濃度呈“倒U型”關(guān)系，濃度分別為2.78和2.31 mg·L-1時，gst和gr的相對表達(dá)量最高。2.31～3.33 mg·L-1的BPAF顯著上調(diào)蝌蚪體內(nèi)trx和gpx的轉(zhuǎn)錄水平，呈線性劑量-效應(yīng)關(guān)系。

2.3 BPA及替代品對非洲爪蛙蝌蚪體內(nèi)熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響

RT-qPCR結(jié)果表明(圖3)，暴露48 h后，4.82～8.33 mg·L-1的BPA顯著下調(diào)蝌蚪體內(nèi)hsp27和hsp90的轉(zhuǎn)錄水平，4.82～10.00 mg·L-1的BPA對蝌蚪體內(nèi)hsp70的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著影響。與BPA不同，7.23～12.50 mg·L-1的BPF對蝌蚪體內(nèi)hsp27、hsp70和hsp90的表達(dá)均沒有顯著影響，但15.00 mg·L-1的BPF顯著抑制hsp27和hsp90的表達(dá)水平。2.31～3.33 mg·L-1的BPAF顯著上調(diào)蝌蚪體內(nèi)hsp70和hsp90的轉(zhuǎn)錄水平，呈線性劑量-效應(yīng)關(guān)系，但對蝌蚪體內(nèi)hsp27基因沒有顯著影響。

3 討論(Discussion)

檢測結(jié)果表明，BPA及替代品對非洲爪蛙蝌蚪的48 h-LC50排序?yàn)椋築PF(11.01 mg·L-1)>BPA(7.54 mg·L-1)>BPAF(2.87 mg·L-1)。根據(jù)危險化學(xué)品分類準(zhǔn)則[29]，BPA和BPAF對非洲爪蛙的毒性為中等毒性，BPF對非洲爪蛙的毒性略低于中等毒性標(biāo)準(zhǔn)。最近的研究表明，BPA及替代品對黑斑蛙和斑馬魚的毒性均為中等毒性[15-16]。

圖2 BPA(a)、BPF(b)和BPAF(c)對非洲爪蛙蝌蚪的氧化應(yīng)激相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的影響注：*表示P<0.05。Fig. 2 Oxidative stress related gene transcription level of Xenopus laevis tadpoles after exposure to BPA (a), BPF (b) and BPAF (c)Note: *represents P<0.05.

圖3 BPA(a)、BPF(b)和BPAF(c)對非洲爪蛙蝌蚪的熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄水平的影響注：*表示P<0.05。Fig. 3 Transcriptional levels of heat-shock protein of Xenopus laevis tadpoles after exposure to BPA (a), BPF (b) and BPAF (c)Note: *represents P<0.05.

BPA和BPF對非洲爪蛙蝌蚪體內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)基因gr、gst和trx轉(zhuǎn)錄水平的影響呈線性劑量-效應(yīng)關(guān)系。對比BPF與BPA相似濃度暴露組(如8.68 mg·L-1BPF暴露組與8.33 mg·L-1BPA暴露組)蝌蚪體內(nèi)gst、gr和trx的相對表達(dá)量后，發(fā)現(xiàn)BPF暴露組蝌蚪體內(nèi)的gst基因的相對表達(dá)量高于BPA暴露組，BPF暴露組蝌蚪體內(nèi)gr和trx的相對表達(dá)量與BPA暴露組類似。整體來看，BPF對蝌蚪體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響與BPA相近。分析BPAF和BPA暴露組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，2.31 mg·L-1的BPAF暴露組中蝌蚪體內(nèi)gst、gr和trx基因的相對表達(dá)量與10.00 mg·L-1的BPA暴露組類似，此結(jié)果說明2.31 mg·L-1的BPAF與10.00 mg·L-1的BPA產(chǎn)生類似的氧化應(yīng)激效應(yīng)，所以BPAF對蝌蚪體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響強(qiáng)于BPA。另發(fā)現(xiàn)，BPA及替代品對蝌蚪體內(nèi)gpx基因表達(dá)水平的影響有所不同。BPA暴露組蝌蚪體內(nèi)gpx表達(dá)被顯著下調(diào)；12.50 mg·L-1的BPF顯著上調(diào)蝌蚪體內(nèi)gpx的表達(dá)水平，7.23～8.68 mg·L-1則顯著下調(diào)gpx的表達(dá)水平；BPAF顯著上調(diào)蝌蚪體內(nèi)gpx基因的表達(dá)水平，呈線性劑量-效應(yīng)關(guān)系。有研究表明，暴露于不同重金屬污染物的生物體內(nèi)gpx的表達(dá)水平表現(xiàn)為雙向效應(yīng)(降低或增加)，主要取決于污染物種類[20-35]。這可能為BPA及替代品對蝌蚪體內(nèi)gpx轉(zhuǎn)錄水平的不同影響提供合理的解釋。綜合考慮以上結(jié)果，BPF對非洲爪蛙體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響與BPA相近，BPAF強(qiáng)于BPA。

BPA及替代品對非洲爪蛙蝌蚪體內(nèi)熱休克蛋白表達(dá)的影響結(jié)果表明，BPA暴露組(10.00 mg·L-1除外)蝌蚪體內(nèi)hsp27和hsp90的表達(dá)被顯著下調(diào)。Morales等[21]研究發(fā)現(xiàn)，蝸牛暴露于100和500 μg·L-1BPA 48 h后，體內(nèi)hsp70和hsp90基因的轉(zhuǎn)錄水平下降。還有研究表明，秀麗隱桿線蟲暴露于250和500 μmol·L-1BPA 24 h后，體內(nèi)的hsp70基因表達(dá)下調(diào)[17]。以上研究的實(shí)驗(yàn)物種和BPA暴露濃度與本實(shí)驗(yàn)不同，但BPA對生物體內(nèi)熱休克蛋白的影響與本研究BPA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。此外，BPF、BPAF對蝌蚪體內(nèi)熱休克蛋白的影響與BPA不一致：7.23～12.50 mg·L-1的BPF對蝌蚪體內(nèi)熱休克蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響，15.00 mg·L-1的BPF顯著下調(diào)hsp27和hsp90的表達(dá)；BPAF對蝌蚪體內(nèi)hsp27的表達(dá)沒有顯著影響，但BPAF顯著上調(diào)蝌蚪體內(nèi)hsp70和hsp90的表達(dá)，呈線性劑量-效應(yīng)關(guān)系。總體來看，BPA和BPAF均影響蝌蚪體內(nèi)熱休克蛋白的表達(dá)水平，而BPF對蝌蚪體內(nèi)熱休克蛋白表達(dá)沒有顯著影響。

綜上所述，BPA及替代品對非洲爪蛙蝌蚪的毒性強(qiáng)弱順序?yàn)椋築PAF>BPA>BPF；BPAF對非洲爪蛙體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響最大，BPF與BPA相近；BPA和BPAF顯著影響非洲爪蛙體內(nèi)熱休克蛋白表達(dá)水平，BPF沒有影響顯著影響。本文可為BPA及替代品的生產(chǎn)和使用以及相應(yīng)的環(huán)境管理提供毒理學(xué)參考數(shù)據(jù)。