王帥，王玥，梁英,#，鄭立,3,*，孫承君，鞠鵬

1. 中國(guó)海洋大學(xué)，海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266003 2. 自然資源部第一海洋研究所，海洋生態(tài)環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266061 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，海洋國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，青島 266071

塑料因其優(yōu)良的理化特性，在生產(chǎn)和生活中被廣泛應(yīng)用[1-2]。每年全球塑料消費(fèi)量已超過3億t，其中約有5%～10%的塑料會(huì)進(jìn)入海洋[3-5]。目前，從赤道到極地的海水[3,6]、沉積物[7-8]以及生物鏈各層級(jí)生物[9]中均檢測(cè)到了塑料的存在，可見塑料已成為全球性的環(huán)境問題。有關(guān)微塑料的生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)研究主要聚焦于鯨魚[10]、硬骨魚類[11-13]、棘皮動(dòng)物[2,5]、軟體動(dòng)物[14-15]、環(huán)節(jié)動(dòng)物[16-17]和浮游動(dòng)物[18-19]等海洋動(dòng)物，限制其運(yùn)動(dòng)和攝食等物理?yè)p傷是目前微塑料產(chǎn)生危害的主要原因。然而，塑料對(duì)海洋生物產(chǎn)生物理?yè)p傷的同時(shí)，還會(huì)對(duì)海洋生物產(chǎn)生化學(xué)毒性效應(yīng)[20]。塑料中的有毒添加劑，如增塑劑、阻燃劑和抗菌劑等，會(huì)被釋放到海洋中，所帶來的影響可能比微塑料從周圍環(huán)境中吸附的持久性有機(jī)污染物的毒害作用更大[21-23]。

微藻作為海洋中最主要的初級(jí)生產(chǎn)力，是維持海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡不可或缺的一部分，與海洋中的塑料，特別是微塑料，具有巨大的相互作用潛力[24]。且微藻生長(zhǎng)周期短、易培養(yǎng)、對(duì)有毒物質(zhì)敏感并且無攝食過程，是生態(tài)毒理學(xué)研究中常用的測(cè)試生物[25]。已有研究報(bào)道了微塑料對(duì)微藻的毒性效應(yīng)，部分研究認(rèn)為，微塑料的毒性較小，不會(huì)對(duì)海洋微藻構(gòu)成危害[25-27]，然而也有學(xué)者認(rèn)為，它能造成微藻細(xì)胞光合系統(tǒng)的損傷[24,28-29]。目前，關(guān)于微塑料對(duì)海洋微藻毒性效應(yīng)的報(bào)道較少，且對(duì)其毒性效應(yīng)強(qiáng)弱等問題還存在一定的爭(zhēng)議，研究多側(cè)重于探討物理作用為主的毒性，然而對(duì)其所含有的化學(xué)添加劑的毒性效應(yīng)仍需要進(jìn)一步的探索。

聚氯乙烯(polyvinyl chloride, PVC)作為世界第二大通用塑料，已經(jīng)成為人們高度關(guān)注的海洋塑料污染物。在PVC生產(chǎn)過程中會(huì)添加不同種類的增塑劑，從而改善塑料的塑性和功能，特別是鄰苯二甲酸酯類增塑劑，作為典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物會(huì)對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重危害。截至目前，國(guó)內(nèi)外研究主要側(cè)重于聚苯乙烯(polystyrene, PS)、PVC和聚乙烯(polyethylene, PE)等塑料微粒的物理作用對(duì)微藻的影響[25-26]，PVC本身的化學(xué)毒性對(duì)微藻帶來的影響暫未見相關(guān)研究。本文選取3種不同門類的海洋微藻球包括等鞭金藻(Isochrysisgalbana)、中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)和小球藻(Chlorellasp.)作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，開展PVC浸出液對(duì)這3種微藻葉綠素?zé)晒馓匦院图?xì)胞密度毒性效應(yīng)的研究，并計(jì)算出葉綠素?zé)晒鈪?shù)和細(xì)胞密度的EC50，探究不同門類的微藻對(duì)PVC浸出液的敏感性，以期為塑料對(duì)海洋微藻的化學(xué)毒性研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 PVC塑料浸出液的制備

實(shí)驗(yàn)所用軟PVC(增塑劑>30%)和硬PVC(增塑劑<10%)均購(gòu)于上海陽(yáng)勵(lì)機(jī)電科技有限公司，將2種PVC剪成2～5 mm碎片后浸入滅菌海水，海水中塑料質(zhì)量分別為50、100和200 g·L-1，在恒溫(37 ℃)下浸泡14 d，浸泡過程中不斷攪動(dòng)，過濾后獲得PVC浸出液(濃度用海水中塑料的質(zhì)量表示)。

1.2 PVC塑料浸出液中16種鄰苯二甲酸酯類的測(cè)定

采用GC7890A-MS5975C型GC-MS聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)參照顧浩琦等[30]GC-MS方法檢測(cè)軟PVC和硬PVC浸出液(200 g·L-1)中的鄰苯二甲酸酯類增塑劑。表1列出了16種鄰苯二甲酸酯類增塑劑，包括含有除鄰苯二甲酸二苯酯外的15種成分的混標(biāo)(美國(guó)AccuStandard公司)，以及鄰苯二甲酸二苯酯標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司)。

1.3 藻種及培養(yǎng)方法

實(shí)驗(yàn)所用藻種為球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)MACC/H59、中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)MACC/B129和小球藻(Chlorellasp.)MACC/C95，均取自中國(guó)海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫(kù)。

實(shí)驗(yàn)在250 mL的三角燒瓶中進(jìn)行，所用培養(yǎng)基為f/2培養(yǎng)基[31]。利用不同濃度的軟PVC和硬PVC浸出液替代海水，分別對(duì)以上3種微藻進(jìn)行脅迫實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，以不添加PVC的空白樣作為對(duì)照組。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的球等鞭金藻、中肋骨條藻和小球藻分別以3.00×105、1.50×105和1.30×105個(gè)·mL-1的接種密度接入上述不同濃度和材質(zhì)的PVC浸出液中進(jìn)行脅迫處理。藻種培養(yǎng)條件為溫度(20±1) ℃，連續(xù)光照(光照強(qiáng)度3 000 lx)，鹽度31‰，每天搖動(dòng)培養(yǎng)瓶3～5次，培養(yǎng)時(shí)間為4 d。脅迫24、48、72和96 h后取樣，測(cè)定葉綠素?zé)晒飧黜?xiàng)參數(shù)和細(xì)胞密度。

1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)和細(xì)胞密度的測(cè)定

葉綠素?zé)晒飧黜?xiàng)參數(shù)，包括PSⅡ最大量子產(chǎn)量(Fv/Fm)、PSⅡ?qū)嶋H量子產(chǎn)量(Yield)、光化學(xué)淬滅(qP)和PSⅡ最大相對(duì)電子傳遞速率(rETRmax)測(cè)定參照Liang等[32]的方法，球等鞭金藻和小球藻細(xì)胞密度測(cè)定采用血球計(jì)數(shù)板法，中肋骨條藻細(xì)胞密度測(cè)定采用吸光度法。

表1 16種鄰苯二甲酸酯類(PAEs)增塑劑標(biāo)準(zhǔn)品名稱、縮寫及純度
Table 1 Chemical names, abbreviations and purities of standard materials of the sixteen phthalate esters (PAEs)

序號(hào)Number名稱Compound縮寫Abbreviation純度/%Purity/%1鄰苯二甲酸二甲酯Dimethyl phthalateDMP≥98.002鄰苯二甲酸二乙酯Diethyl phthalateDEP≥99.903鄰苯二甲酸二異丁酯Diisobutyl phthalateDIBP100.004鄰苯二甲酸二丁酯Dibutyl phthalateDBP≥98.405鄰苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯Bis (2-methoxy) ethyl phthalateBMEP≥97.706鄰苯二甲酸二-(4-甲基-2-戊基)酯Bis (4-methyl-2-amyl) phthalateBMPP100.007鄰苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯Bis (2-ethoxy) ethyl phthalateBEEP100.008鄰苯二甲酸二戊酯Dipentyl phthalateDPP≥98.509鄰苯二甲酸二己酯Dihexyl phthalateDHXP≥99.0010鄰苯二甲酸丁基芐基酯Butyl benzyl phthalateBBP≥98.4011鄰苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯Di-(2-butoxy) ethyl phthalateDBEP≥99.0012鄰苯二甲酸二環(huán)己酯Dicyclohexyl phthalateDCHP100.0013鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯Di (2-ethyl) hexyl phthalateDEHP≥99.6014鄰苯二甲酸二苯酯Diphenyl phthalate/≥98.0015鄰苯二甲酸二辛酯Dioctyl phthalateDNOP≥99.1016鄰苯二甲酸二壬酯Dinonyl phthalateDNP≥97.00

1.5 EC50的測(cè)定

采用閆學(xué)平等[33]的方法計(jì)算葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm的EC50，采用趙玉艷和蔡磊明[34]的生長(zhǎng)速率法計(jì)算細(xì)胞密度的EC50。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Origin(v. 8.5)進(jìn)行繪圖，利用SPSS(v. 19.0)軟件，運(yùn)用雙因素方差分析和多重比較方法(P<0.05表示差異顯著)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果(Results)

2.1 不同種類PVC浸出液對(duì)球等鞭金藻光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度的影響

圖1((a)～(d))和圖2(a)給出了球等鞭金藻光合作用相關(guān)參數(shù)和細(xì)胞密度在不同濃度軟PVC浸出液及脅迫時(shí)間作用下的變化趨勢(shì)。雙因素方差分析結(jié)果表明，軟PVC浸出液濃度、脅迫時(shí)間及二者交互作用(濃度×?xí)r間)對(duì)球等鞭金藻的4項(xiàng)光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度均有顯著影響(P<0.05)，其中軟PVC浸出液濃度對(duì)Fv/Fm、Yield和rETRmax影響最顯著，脅迫時(shí)間對(duì)細(xì)胞密度影響最顯著(表2)。多重比較結(jié)果顯示，隨著軟PVC浸出液濃度的上升，球等鞭金藻的4項(xiàng)光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度均呈下降趨勢(shì)(表2)。高濃度軟PVC浸出液(100～200 g·L-1)處理組的Fv/Fm、Yield、qP、rETRmax和細(xì)胞密度顯著低于對(duì)照及50 g·L-1處理組，4項(xiàng)光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度均在200 g·L-1處理組達(dá)到最小值。100 g·L-1和200 g·L-1處理組的球等鞭金藻光合作用參數(shù)(除Yield外)均在0～48 h迅速下降，之后緩慢上升，但仍明顯低于對(duì)照及50 g·L-1處理組相關(guān)參數(shù)。96 h時(shí)，200 g·L-1處理組的細(xì)胞密度最低，其次是100 g·L-1處理組，分別為對(duì)照組的3.20%和3.90%。

圖1((e)～(h))和圖2(b)給出了球等鞭金藻光合作用相關(guān)參數(shù)和細(xì)胞密度在不同濃度硬PVC浸出液及脅迫時(shí)間作用下的變化趨勢(shì)。雙因素方差分析結(jié)果表明，硬PVC浸出液濃度和脅迫時(shí)間對(duì)球等鞭金藻的4項(xiàng)光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度均有顯著影響(P<0.05)，二者交互作用(濃度×?xí)r間)對(duì)4項(xiàng)光合作用參數(shù)有顯著影響(P<0.05)，其中，硬PVC浸出液濃度對(duì)Yield和rETRmax的影響最顯著，脅迫時(shí)間對(duì)細(xì)胞密度影響最顯著(表2)。多重比較結(jié)果顯示，硬PVC浸出液脅迫下球等鞭金藻的Fv/Fm顯著高于對(duì)照組，但3個(gè)處理組間無顯著差異；Yield、qP和rETRmax均在高濃度處理組(100～200 g·L-1)中達(dá)到最大值，且顯著高于對(duì)照組及50 g·L-1處理組；而高濃度處理組(100～200 g·L-1)的細(xì)胞密度顯著低于對(duì)照及50 g·L-1處理組(表2)。72 h時(shí)，細(xì)胞密度在100 g·L-1處理組中達(dá)到最小值，為對(duì)照組的67.90%。

2.2 不同種類PVC浸出液對(duì)中肋骨條藻光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度的影響

圖3((a)～(d))和圖2(c)給出了中肋骨條藻光合作用相關(guān)參數(shù)和細(xì)胞密度在不同濃度軟PVC浸出液及脅迫時(shí)間作用下的變化趨勢(shì)。雙因素方差分析結(jié)果表明，軟PVC浸出液濃度、脅迫時(shí)間及二者交互作用(濃度×?xí)r間)對(duì)中肋骨條藻的Fv/Fm、Yield、qP、rETRmax和細(xì)胞密度均有顯著影響(P<0.05)，其中，軟PVC浸出液濃度對(duì)上述4項(xiàng)光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度的影響最顯著，脅迫時(shí)間對(duì)Fv/Fm、qP、rETRmax和細(xì)胞密度的影響最顯著(表3)。多重比較結(jié)果顯示，F(xiàn)v/Fm、Yield、qP、rETRmax和細(xì)胞密度隨軟PVC浸出液濃度上升而下降，上述參數(shù)均在200 g·L-1處理組達(dá)到最小值，且顯著低于各處理組(表3)。隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，F(xiàn)v/Fm、Yield、qP和rETRmax均呈先下降后上升的趨勢(shì)。96 h時(shí)，200 g·L-1處理組的細(xì)胞密度達(dá)到最小值，占對(duì)照組的11.90%。

圖3((e)～(h))和圖2(d)給出了中肋骨條藻光合作用相關(guān)參數(shù)和細(xì)胞密度在不同濃度硬PVC浸出液及脅迫時(shí)間作用下的變化趨勢(shì)。雙因素方差分析結(jié)果表明，硬PVC浸出液濃度、脅迫時(shí)間及二者交互作用(濃度×?xí)r間)對(duì)中肋骨條藻的Fv/Fm、Yield、qP和rETRmax和細(xì)胞密度均有顯著影響(P<0.05)，其中，硬PVC浸出液濃度對(duì)rETRmax的影響最顯著，脅迫時(shí)間對(duì)細(xì)胞密度的影響最顯著(表3)。多重比較結(jié)果顯示，上述4項(xiàng)光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度均在高濃度處理組(100～200 g·L-1)達(dá)到最小值，且顯著低于對(duì)照組(表3)。Fv/Fm、qP和rETRmax隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈緩慢下降趨勢(shì)，Yield隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)先上升后下降。實(shí)驗(yàn)后期(72 h)，200 g·L-1處理組的細(xì)胞密度達(dá)到最小值，為對(duì)照組的82.50%。

2.3 不同種類PVC浸出液對(duì)小球藻光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度的影響

圖4((a)～(d))和圖2(e)給出了小球藻光合作用相關(guān)參數(shù)和細(xì)胞密度在不同濃度軟PVC浸出液及脅迫時(shí)間作用下的變化趨勢(shì)。雙因素方差分析結(jié)果表明，軟PVC浸出液濃度對(duì)小球藻的Fv/Fm、Yield和qP有影響(P<0.05)，脅迫時(shí)間對(duì)小球藻的4項(xiàng)光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度均有影響(P<0.05)，二者交互作用(濃度×?xí)r間)僅對(duì)該藻株的Yield和qP有影響(P<0.05)，其中脅迫時(shí)間對(duì)Yield和qP的影響最顯著(表4)。多重比較結(jié)果顯示，高濃度處理組(100～200 g·L-1)的Fv/Fm、Yield、qP和rETRmax值低于對(duì)照組；200 g·L-1處理組的細(xì)胞密度低于對(duì)照組，其他處理組與對(duì)照組無顯著差異(表4)。隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，上述4項(xiàng)光合作用參數(shù)總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在96 h時(shí)，100 g·L-1處理組的細(xì)胞密度達(dá)到最小值，是對(duì)照組的92.50%。

圖1 軟聚氯乙烯(PVC)和硬PVC浸出液脅迫對(duì)球等鞭金藻光合作用參數(shù)(Fv/Fm、Yield、qP和rETRmax)的影響注：Fv/Fm、Yield、qP和rETRmax分別表示PSⅡ最大量子產(chǎn)量、PSⅡ?qū)嶋H量子產(chǎn)量、光化學(xué)淬滅和PSⅡ最大相對(duì)電子傳遞速率。Fig. 1 Effects of soft and hard polyvinyl chloride (PVC) extract stress on the photosynthetic parameters (Fv/Fm, Yield, qP and rETRmax) of I. galbanaNote: Fv/Fm, Yield, qP and rETRmax stand for the maximum efficiency quantum yield of PSⅡ, the actual photochemical efficiency of PSⅡ in the light, photochemical quenching and the maximum relative electron transport rate, respectively.

圖2 軟PVC浸出液((a)、(c)、(e))和硬PVC浸出液((b)、(d)、(f))脅迫對(duì)3種海洋微藻細(xì)胞密度的影響注：*表示與對(duì)照組(100%)差異顯著。Fig. 2 Effects of soft PVC extract ((a), (c), (e)) and hard PVC extract ((b), (d), (f)) stress on cell density of three marine microalgae strainsNote: *represents significant difference (P<0.05) with control (100%).

圖4((e)～(h))和圖2(f)給出了小球藻光合作用相關(guān)參數(shù)和細(xì)胞密度在不同濃度硬PVC浸出液及脅迫時(shí)間作用下的變化趨勢(shì)。雙因素方差分析結(jié)果表明，硬PVC浸出液濃度對(duì)小球藻Fv/Fm和Yield有影響(P<0.05)，脅迫時(shí)間對(duì)小球藻的4項(xiàng)光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度均有影響(P<0.05)，二者交互作用(濃度×?xí)r間)對(duì)該藻株的Fv/Fm、Yield和qP有影響(P<0.05)，其中脅迫時(shí)間對(duì)Yield和qP的影響最顯著(表4)。多重比較結(jié)果顯示，硬PVC浸出液各處理組的Fv/Fm略高于對(duì)照組，但組間差異不顯著；各處理組的Yield略低于對(duì)照組，組間差異亦不顯著；qP、rETRmax和細(xì)胞密度隨濃度變化不明顯(表4)。各光合作用參數(shù)隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈先輕微上升后有下降趨勢(shì)。72 h時(shí)，細(xì)胞密度在100 g·L-1處理組最低，為對(duì)照組的93.30%。

圖3 軟PVC和硬PVC浸出液脅迫對(duì)中肋骨條藻光合作用參數(shù)(Fv/Fm、Yield、qP和rETRmax)的影響Fig. 3 Effects of soft and hard PVC extract stress on the photosynthetic parameters (Fv/Fm, Yield, qP and rETRmax) of S. costatum

表2 軟PVC和硬PVC浸出液濃度和脅迫時(shí)間對(duì)球等鞭金藻光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度的雙因子方差分析(a)和多重比較(b)結(jié)果Table 2 Summary of multiple factors analysis of variance (MANOVA) (a) and S-N-K multiple comparison test (b) results on the photosynthetic parameters and cell density of I. galbana exposed to different concentrations of soft and hard PVC extract for different time

注：多重比較結(jié)果按升序排列，即a

Note: Multiple comparison test results are arranged in increasing order from left to right a

表3 軟PVC和硬PVC浸出液濃度和脅迫時(shí)間對(duì)中肋骨條藻光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度的雙因子方差分析(a)和多重比較(b)結(jié)果Table 3 Summary of MANOVA (a) and S-N-K multiple comparison test (b) results on the photosynthetic parameters and cell density of S. costatum exposed to different concentrations of soft and hard PVC extract for different time

注：多重比較結(jié)果按升序排列，即a

Note: Multiple comparison test results are arranged in increasing order from left to right a

表4 軟PVC和硬PVC浸出液濃度和脅迫時(shí)間對(duì)小球藻光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度的雙因子方差分析(a)和多重比較(b)結(jié)果Table 4 Summary of MANOVA (a) and S-N-K multiple comparison test (b) results on the photosynthetic parameters and cell density of Chlorella sp. exposed to different concentrations of soft and hard PVC extract for different time

注：多重比較結(jié)果按升序排列，即a

Note: Multiple comparison test results are arranged in increasing order from left to right a

2.4 EC50

表5給出了不同種類和濃度的PVC浸出液脅迫下，3種海洋微藻Fv/Fm和細(xì)胞密度在72～96 h的EC50變化情況，其大小與PVC浸出液種類和微藻種類有關(guān)。軟PVC浸出液抑制3種海洋微藻所得的EC50為：球等鞭金藻4.46～113.14 g·L-1，中肋骨條藻30.72～89.44 g·L-1，小球藻未達(dá)到半致死濃度。硬PVC浸出液脅迫下，3種海洋微藻均未達(dá)到半致死濃度。因此，3種海洋微藻對(duì)軟PVC浸出液的敏感性順序?yàn)榍虻缺藿鹪?金藻門)>中肋骨條藻(硅藻門)>小球藻(綠藻門)。

圖4 軟PVC和硬PVC浸出液脅迫對(duì)小球藻光合作用參數(shù)(Fv/Fm、Yield、qP和rETRmax)的影響Fig. 4 Effects of soft and hard PVC extract stress on the photosynthetic parameters (Fv/Fm, Yield, qP and rETRmax) of Chlorella sp.

2.5 軟PVC和硬PVC浸出液的GC-MS檢測(cè)結(jié)果

圖5給出了軟PVC和硬PVC浸出液中所含塑化劑的類型和含量。軟PVC中鄰苯二甲酸二辛酯(dioctyl phthalate, DNOP)濃度為41.05 μg·L-1，鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)濃度為175.70 μg·L-1；硬PVC中DNOP濃度為97.74 μg·L-1，鄰苯二甲酸二壬酯(dinonyl phthalate, DNP)濃度為56.03 μg·L-1。

圖5 軟PVC和硬PVC浸出液中所含塑化劑的類型和含量注：軟PVC中DNOP濃度為41.05 μg·L-1，DBP濃度為175.70 μg·L-1；硬PVC中DNOP濃度為97.74 μg·L-1，DNP濃度為56.03 μg·L-1。Fig. 5 Types and contents of plasticizers in soft PVC and hard PVC extractNote: The concentrations of DNOP and DBP are 41.05 and 175.70 μg·L-1 in the soft PVC extract; the concentrations of DNOP and DNP are 97.74 and 56.03 μg·L-1 in the hard PVC extract.

表5 PVC浸出液對(duì)3種海洋微藻Fv/Fm和細(xì)胞密度的半數(shù)效應(yīng)濃度(EC50)變化Table 5 Half-effective concentration (EC50) for Fv/Fm and cell density of 3 marine microalgae strains exposed to PVC extract

注：Ns表示數(shù)據(jù)未得出。

Note: Ns indicates that the data is not detected.

3 討論(Discussion)

葉綠素?zé)晒馐窃u(píng)估脅迫環(huán)境下微藻光合作用特征的有效方法，其時(shí)變信息與光合反應(yīng)進(jìn)程密切偶聯(lián)，可以快速準(zhǔn)確地反映出外界環(huán)境變化對(duì)微藻光合作用過程的影響，近年來葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)正在逐漸取代傳統(tǒng)的分光光度法，在植物逆境生理研究中得到快速的發(fā)展和應(yīng)用。借助葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)變化，可深入了解污染物對(duì)微藻光合系統(tǒng)(特別是PSⅡ)的影響及微藻對(duì)逆境的響應(yīng)機(jī)理[35-37]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，軟PVC浸出液脅迫后，球等鞭金藻和中肋骨條藻的光合作用參數(shù)Fv/Fm、Yield、qP和rETRmax均隨PVC浸出液濃度增大顯著降低，在高濃度處理組(100～200 g·L-1)達(dá)到最小值，小球藻則無顯著變化。Fv/Fm下降表明，軟PVC浸出液使球等鞭金藻和中肋骨條藻的PSⅡ反應(yīng)中心活性降低，阻礙了光合電子傳遞過程。Yield下降說明軟PVC浸出液阻礙上述2種微藻的藻細(xì)胞同化力的形成。qP下降表示上述2種微藻在軟PVC浸出液脅迫下電子傳遞受阻，進(jìn)行光合作用的電子減少，以熱或其他形式耗散的光能增加。rETRmax下降則說明軟PVC浸出液使上述2種藻的電子傳遞效率降低。硬PVC浸出液對(duì)3種微藻光合作用參數(shù)的影響因藻種不同有所差異。硬PVC浸出液脅迫下，球等鞭金藻各處理組的光合作用參數(shù)Fv/Fm、Yield、qP和rETRmax均高于對(duì)照組；中肋骨條藻的4項(xiàng)光合作用參數(shù)顯著降低；小球藻的上述光合作用參數(shù)則與對(duì)照組無顯著差異。其中，低濃度(50 g·L-1)硬PVC浸出液能夠促進(jìn)球等鞭金藻的光合能力的這一結(jié)果，與胡芹芹等[29]和劉偉杰等[38]的所得結(jié)論一致，原因可能是微藻對(duì)環(huán)境脅迫具有一定的耐受能力，低濃度的毒性物質(zhì)可誘導(dǎo)藻細(xì)胞超氧化物歧化酶(SOD)活性迅速增加，從而增強(qiáng)對(duì)活性氧的清除能力以保持自由基平衡，最終降低了塑料浸出液的毒性。綜合上述結(jié)果可以看出，軟PVC浸出液脅迫對(duì)球等鞭金藻、中肋骨條藻和小球藻的影響大于硬PVC浸出液，這可能是因?yàn)檐汸VC中增塑劑含量大于硬PVC。有研究表明，當(dāng)PVC的增塑劑含量<10%，其制品為硬質(zhì)(即硬PVC)；若>30%，其制品為軟質(zhì)(即軟PVC)[39]。增塑劑是PVC主要毒性來源，如鄰苯二甲酸酯類，其相對(duì)分子質(zhì)量少，通過氫鍵或范德華力而非化學(xué)鍵連接到PVC高分子鏈上，很容易向外部遷移，污染微藻生存環(huán)境[40-41]。

目前，有關(guān)增塑劑對(duì)水生生物毒性的研究多集中于對(duì)魚蝦的生長(zhǎng)抑制作用及致死率等方面[12,42-43]，而對(duì)微藻的毒性研究還相對(duì)較少[44-45]。有研究結(jié)果表明，單一增塑劑能夠抑制藻細(xì)胞增殖，且隨濃度升高，抑制作用增強(qiáng)[37,46-47]，可見增塑劑作為一種具有生態(tài)毒性效應(yīng)的環(huán)境激素對(duì)微藻的生長(zhǎng)具有明顯的干擾作用。而有關(guān)多種增塑劑聯(lián)合毒性對(duì)海洋微藻的影響較少報(bào)道，李英[48]研究了鄰苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate, DEP)和鄰苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)聯(lián)合暴露對(duì)角毛藻(Chaetocerossp.)、鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)和新月柱鞘藻(Cylindrothecaclosterium)的影響，王晶晶等[49]探討了DEP和壬基酚(nonylphenol, NP)對(duì)杜氏鹽藻(D.salina)的聯(lián)合毒性效應(yīng)，結(jié)果表明，增塑劑在等濃度聯(lián)合作用下對(duì)微藻的生長(zhǎng)具有顯著抑制效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)所用PVC浸出液是含有多種PAEs的混合液，軟PVC浸出液中主要含有DBP和DNOP這2種塑化劑成分，硬PVC浸出液中主要含有DNP和DNOP這2種塑化劑成分。本研究結(jié)果表明，軟PVC浸出液對(duì)球等鞭金藻和中肋骨條藻的生長(zhǎng)均具有顯著脅迫作用；硬PVC浸出液對(duì)中肋骨條藻的生長(zhǎng)具有顯著脅迫作用。特別是不同濃度軟PVC浸出液作用下，上述微藻的細(xì)胞密度均受到不同程度的抑制，且抑制程度與軟PVC浸出液的濃度呈正相關(guān)，在高濃度處理組(100～200 g·L-1)達(dá)到最小值。這與胡芹芹等[29]、黃博珠等[44]、況琪軍等[45]和別聰聰?shù)萚46]的研究結(jié)果一致。上述研究結(jié)果表明，PVC浸出液的毒性效應(yīng)表現(xiàn)在可影響微藻的光合作用，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，同時(shí)引起藻細(xì)胞的膜質(zhì)過氧化程度增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜及類囊體膜的結(jié)構(gòu)損傷和功能喪失，從而抑制藻細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝[28-29]。微藻在受到化學(xué)物質(zhì)脅迫時(shí)，在脅迫早期階段可能會(huì)出現(xiàn)對(duì)微藻的生長(zhǎng)及其生化指標(biāo)具有促進(jìn)作用的現(xiàn)象[50]。楊慧麗和段舜山[47]在研究DBP對(duì)三角褐指藻的生態(tài)毒性效應(yīng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，在脅迫12 h時(shí)，在濃度為5 mg·L-1的DBP處理?xiàng)l件下，三角褐指藻的PSⅡ的潛在活性(Fv/Fo)、Fv/Fm、Yield和光合電子傳遞效率(ETR)等光合作用參數(shù)逐漸上升，這與本實(shí)驗(yàn)中硬PVC浸出液對(duì)球等鞭金藻的研究結(jié)果一致，該機(jī)理到目前為止尚未闡明，還需要實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證實(shí)。

有關(guān)PVC浸出液對(duì)海洋微藻葉綠素?zé)晒馓匦院蜕L(zhǎng)的影響目前還未見報(bào)道，但關(guān)于其他外源性因子，如重金屬[34,51-53]、抗生素[54-55]和持久性有機(jī)污染物[56-57]對(duì)海洋微藻光合作用和生長(zhǎng)的報(bào)道已有不少。一般來說，微藻對(duì)外源性因子的敏感性順序?yàn)榻鹪彘T>硅藻門>綠藻門。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，3種海洋微藻對(duì)軟PVC浸出液的敏感性順序?yàn)榍虻缺藿鹪?中肋骨條藻>小球藻，由此推測(cè)海水中塑料持續(xù)增多可能會(huì)影響海洋生態(tài)系統(tǒng)中微藻的種群群落結(jié)構(gòu)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)球等鞭金藻和中肋骨條藻的Fv/Fm和細(xì)胞密度對(duì)硬PVC浸出液的敏感性不強(qiáng)。小球藻的Fv/Fm和細(xì)胞密度對(duì)軟、硬PVC浸出液的敏感性不強(qiáng)，均未達(dá)到半致死濃度，說明硬PVC浸出液對(duì)3種微藻的毒性效應(yīng)相對(duì)較低，PVC浸出液對(duì)微藻的脅迫作用具有種間差異性。PVC浸出液對(duì)3種微藻的EC50值與PVC浸出液種類、微藻種類有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，球等鞭金藻和中肋骨條藻的4項(xiàng)光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度對(duì)軟PVC浸出液脅迫更為敏感，而對(duì)硬PVC浸出液敏感性較弱，且其光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度均受到軟PVC浸出液不同程度的抑制，抑制程度與軟PVC浸出液的濃度呈正相關(guān)，在高濃度處理組(100～200 g·L-1)時(shí)達(dá)到最低值。小球藻的抗逆性較強(qiáng)，其光合作用參數(shù)和細(xì)胞密度對(duì)軟、硬PVC浸出液脅迫均不敏感。