郭延兵 姚慶和 王新軍

血管外膜成纖維細(xì)胞(vascular adventitial fibroblasts，VAFs)是細(xì)胞外膜的重要細(xì)胞組分之一，其增殖和凋亡之間的失衡導(dǎo)致新生內(nèi)膜形成和病理性血管重構(gòu)，在高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化、血管再狹窄等血管增生性疾病的病理結(jié)局中起決定性作用[1]。干擾素(Interferon，IFN)是一類具有廣譜抗病毒、抗菌、影響細(xì)胞增殖、凋亡以及分化、調(diào)節(jié)免疫功能等多種生物活性的細(xì)胞因子家族。近年來研究顯示，IFN-α通過調(diào)控基因表達(dá)在血管增生性疾病中發(fā)揮重要作用[2]。miR-214-5p是一類與心血管疾病密切相關(guān)的微小RNA(microRNA，miRNA)，研究顯示冠心病患者血漿中miR-214-5p表達(dá)失調(diào)與冠狀動脈側(cè)支循環(huán)形成顯著相關(guān)[3]。miR-214-5p介導(dǎo)運(yùn)動對心臟的保護(hù)作用，是心血管運(yùn)動康復(fù)和其他干預(yù)措施的靶點(diǎn)[4]。

乳脂肪球表皮生長因子8(milk fat globule epidermal growth factor 8，MFGE8)是一種分泌性糖蛋白，其可整合細(xì)胞內(nèi)信號清除死亡細(xì)胞，介導(dǎo)血管細(xì)胞和胞外基質(zhì)在應(yīng)激下的不良反應(yīng)，參與血管衰老和血管重構(gòu)[5]。生物信息學(xué)分析顯示MFGE8是miR-214-5p的潛在靶基因，但I(xiàn)FN-α能否調(diào)控miR-214-5p/MFGE8通路進(jìn)而影響VAFs的增殖和凋亡尚未見文獻(xiàn)報道。因此，本研究擬通過觀察IFN-α對miR-214-5p和MFGE8表達(dá)以及人腦血管外膜成纖維細(xì)胞(human cerebral vascular adventitial fibroblasts，HBVAFs)增殖和凋亡的影響，揭示其作用機(jī)制，以期為IFN-α、miR-214-5p/MFGE8通路在治療血管增生性疾病中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1.材料與試劑:HBVAFs細(xì)胞購自上海澤葉生物科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司；干擾素購自北京三元基因藥業(yè)股份有限公司；miRNA抑制物對照(anti-miR-con)、miR-214-5p抑制物(anti-miR-214-5p)、空載體(pcDNA)、MFGE8過表達(dá)載體(pcDNA-MFGE8)、小干擾RNA對照(si-con)、MFGE8小干擾RNA(si-MFGE8)、野生型熒光素酶報告基因載體(WT-MFGE8)、突變型熒光素酶報告基因載體(MUT-MFGE8)以及PCR引物由上海生工生物工程公司提供；四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑盒購自美國Sigma公司；膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；兔源活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase-3)抗體、兔源B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukaemia-2，Bcl-2)抗體和兔源Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體購自美國CST公司；兔源MFGE8抗體購自美國Santa Cruz公司；β-actin抗體和山羊抗兔Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

2.細(xì)胞分組和處理：復(fù)蘇細(xì)胞后，采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、濕度80%、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度80%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將P3代生長良好的HBVAFs細(xì)胞分為8組，正常培養(yǎng)的HBVAFs細(xì)胞為NC組；用終濃度為2000U/ml的IFN-α處理HBVAFs細(xì)胞24h標(biāo)記為IFN-α組[2]；將anti-miR-con、anti-miR-214-5p、pcDNA、pcDNA-MFGE8分別轉(zhuǎn)染HBVAFs細(xì)胞后，用2000U/ml的IFN-α處理細(xì)胞24h依次標(biāo)記為IFN-α+anti-miR-con組、IFN-α+anti-miR-214-5p組、IFN-α+pcDNA組、IFN-α+pcDNA-MFGE8組；將anti-miR-214-5p分別與si-con、si-MFGE8共轉(zhuǎn)染至HBVAFs細(xì)胞后，用2000U/ml的IFN-α處理細(xì)胞24h，依次標(biāo)記為IFN-α+anti-miR-214-5p+si-con組和IFN-α+anti-miR-214-5p+si-MFGE8組。

3.qRT-PCR檢測miR-214-5p和MFGE8 mRNA的表達(dá)水平：以TRIzol法提取各組HBVAFs細(xì)胞的總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，以cDNA為模板參照qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中miR-214-5p上游引物序列為5′-TCTCTTGCTATAGAAGCACAAC-3′，下游引物序列為5′-TCCTCCACAATCATGCTGTGT-3′；U6上游引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列為5′-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3′；MFGE8上游引物序列為5′-GTGCGTGTGACCTTCTTG-3′，下游引物序列為5′-ACCTGTTACCCACATCCT-3′；β-actin上游引物序列為5′-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3′，下游引物序列為5′-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3′。分別以U6和β-actin為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算miR-214-5p和MFGE8 mRNA的相對表達(dá)水平。

4.MTT法檢測細(xì)胞活力：胰蛋白酶消化處理HBVAFs細(xì)胞并接種于96孔板，按照上述方法進(jìn)行相應(yīng)處理。終止培養(yǎng)前4h向每孔內(nèi)加入20μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5mg/L的MTT。棄去培養(yǎng)基后，加入150μl的DMSO室溫震蕩10min，全自動酶標(biāo)儀檢測490nm波長處的吸光度。

5.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:收集各組細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞后，加入適量的結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入到流式管，按照annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒分別加入5μl的annexin V-FITC和5μl的PI，混勻后室溫避光孵育15min，補(bǔ)加400μl的結(jié)合緩沖液后，立即上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。

6.Western blot法檢測MFGE8、Cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)：收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白，參照BCA試劑盒說明書測定蛋白濃度和純度。取適量的細(xì)胞蛋白，加入等體積的2×上樣緩沖液充分混勻后，置于沸水浴中變性5min。取30μg已變性的蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電泳完畢后，采用轉(zhuǎn)膜裝置將已分離的細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，接著采用5%脫脂牛奶的封閉液室溫條件封閉1h。將Ⅰ抗按照相應(yīng)的比例稀釋后，室溫孵育膜1h，采用TBST洗膜10min，洗3次后，用已稀釋的Ⅱ抗室溫孵育膜1h，TBST漂洗膜3次后，加入化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，隨后于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光和拍照分析。

7.雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-214-5p和MFGE8的靶向關(guān)系：生物信息學(xué)軟件targetscan預(yù)測顯示miR-214-5p與MFGE8的3′-UTR區(qū)域存在部分連續(xù)互補(bǔ)的核苷酸序列，推測MFGE8是miR-214-5p的靶基因并利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C二者的靶向關(guān)系。將含MFGE8的3′-UTR的野生型熒光素酶報告基因載體WT-MFGE8與突變型熒光素酶報告基因載體MUT-MFGE8分別與miR-214-5p 模擬物、miR-con共轉(zhuǎn)染至HBVAFs細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染48h檢測各組細(xì)胞的熒光素酶活性。為證實miR-214-5p對MFGE8的調(diào)控關(guān)系，分別將miR-con、miR-214-5p、anti-miR-con、anti-miR-214-5p轉(zhuǎn)染至HBVAFs細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h檢測采用Western blot法檢測MFGE8蛋白表達(dá)水平變化。

結(jié) 果

1.IFN-α對人腦血管外膜成纖維細(xì)胞miR-214-5p和MFGE8表達(dá)的影響:與NC組比較，IFN-α組人腦血管外膜成纖維細(xì)胞中miR-214-5p的表達(dá)水平(6.43±0.77 vs 1.00±0.12)顯著升高，MFGE8 mRNA(0.41±0.05 vs 0.86±0.09)和MFGE8蛋白(0.29±0.04 vs 0.65±0.07)的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05，圖1)。

圖1 Western blot法檢測人腦血管外膜成纖維細(xì)胞MFGE8表達(dá)

2.干擾miR-214-5p促進(jìn)IFN-α誘導(dǎo)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞增殖：與NC組比較，IFN-α組人腦血管外膜成纖維細(xì)胞miR-214-5p的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活力顯著降低；與IFN-α+anti-miR-con組比較，IFN-α+anti-miR-214-5p組人腦血管外膜成纖維細(xì)胞miR-214-5p的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活力顯著增加(P<0.05)，詳見表1。

3.干擾miR-214-5p抑制IFN-α誘導(dǎo)人腦血管外膜成纖維細(xì)胞凋亡:與NC組比較，IFN-α組人腦血管外膜成纖維細(xì)胞Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著增加；與IFN-α+anti-miR-con組比較，IFN-α+anti-miR-214-5p組人腦血管外膜成纖維細(xì)胞Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05),詳見表2、圖2。

表1 MTT檢測人腦血管外膜成纖維細(xì)胞活力

與NC組比較，*P<0.05；與IFN-α+anti-miR-con組比較，#P<0.05

表2 干擾miR-214-5p抑制IFN-α誘導(dǎo)的人腦血管外膜成纖維細(xì)胞凋亡和影響Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)

與NC組比較，*P<0.05；與IFN-α+anti-miR-con組比較，#P<0.05

圖3 miR-214-5p與MFGE8存在靶向序列并調(diào)控其蛋白表達(dá)A.miR-214-5p與MFGE8存在連續(xù)互補(bǔ)核苷酸序列；B.Western blot法檢測蛋白表達(dá)

4.miR-214-5p靶向調(diào)控MFGE8表達(dá):通過targetscan網(wǎng)站在線預(yù)測顯示，miR-214-5p與MFGE8的3′-UTR區(qū)域存在部分連續(xù)互補(bǔ)的核苷酸序列(圖3A)。雙熒光素酶報告實驗顯示，與miR-con和WT-MFGE8共轉(zhuǎn)染組比較，miR-214-5p 模擬物和WT-MFGE8共轉(zhuǎn)染組人腦血管外膜成纖維細(xì)胞的熒光素酶活性(0.67±0.09 vs 1.00±0.08)顯著降低(P<0.05)；與miR-con和MUT-MFGE8共轉(zhuǎn)染組比較，miR-214-5p 模擬物和MUT-MFGE8共轉(zhuǎn)染組人腦血管外膜成纖維細(xì)胞的熒光素酶活性變化比較(1.07±0.12 vs 1.11±0.16)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與miR-con組比較，miR-214-5p組人腦血管外膜成纖維細(xì)胞MFGE8蛋白的表達(dá)水平(0.26±0.03 vs 0.58±0.06)顯著降低；與anti-miR-con組比較，anti-miR-214-5p組人腦血管外膜成纖維細(xì)胞MFGE8蛋白的表達(dá)水平(0.89±0.09 vs 0.51±0.05)顯著升高(P<0.05,圖3B)。

5.過表達(dá)MFGE8促進(jìn)IFN-α誘導(dǎo)的人腦血管外膜成纖維細(xì)胞增殖抑制細(xì)胞凋亡：與IFN-α+pcDNA組比較，IFN-α+pcDNA-MFGE8組人腦血管外膜成纖維細(xì)胞MFGE8蛋白的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞活力顯著增加，Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05),詳見表3和圖4。

表3 過表達(dá)MFGE8促進(jìn)IFN-α誘導(dǎo)的人腦血管外膜成纖維細(xì)胞增殖抑制細(xì)胞凋亡

與IFN-α+pcDNA組比較，*P<0.05

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和Western blot法檢測MFGE8、Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)A.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；B.Western blot法檢測蛋白表達(dá)

6.干擾MFGE8部分反轉(zhuǎn)anti-miR-214-5p對IFN-α誘導(dǎo)的人腦血管外膜成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的作用:與IFN-α+anti-miR-con+si-con組比較，IFN-α+anti-miR-214-5p+si- MFGE8組人腦血管外膜成纖維細(xì)胞MFGE8蛋白的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活力顯著降低，Cleaved caspase-3和Bax蛋白的表達(dá)水平顯著增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05),詳見表4和圖5。

討 論

近年來，隨著對血管增生性疾病研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)血管外膜成纖維細(xì)胞的激活、過度增殖、細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化是血管增生性疾病進(jìn)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。如何有效地抑制血管外膜成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡對防治血管增生性疾病具有重大意義。

表4 干擾MFGE8和anti-miR-214-5p對IFN-α誘導(dǎo)的人腦血管外膜成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與IFN-α+anti-miR-con+si-con組比較，*P<0.05

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和Western blot法檢測MFGE8、Cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)A.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；B.Western blot法檢測蛋白表達(dá)

IFN被廣泛認(rèn)為是先天免疫應(yīng)答的一個組成部分，自1957年首次發(fā)現(xiàn)干擾素以來，目前已有多種干擾素相繼被發(fā)現(xiàn)，根據(jù)不同受體主要將IFN分為Ⅰ型(IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-δ和IFN-τ)、Ⅱ型(IFN-γ)和Ⅲ型(IFN-λ)3種亞型[6]。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-α通過誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)蛋白16(interferon-inducible protein 16，IFI16)和P21蛋白表達(dá)上調(diào)，降低血管內(nèi)皮細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7，8]。IFN-α還可抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)其凋亡[9,10]。此外，IFN-α還可抑制血管外膜成纖維細(xì)胞的增殖與遷移，促進(jìn)其凋亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn)IFN-α可顯著降低血管外膜成纖維細(xì)胞活力，降低促凋亡蛋白Cleaved caspase-3和Bax的表達(dá)，促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡,與上述研究結(jié)論一致，提示采用IFN-α治療血管增生性疾病具有一定的可行性。

長期起來對miR-214-5p的研究多集中在腫瘤方面，已在骨肉瘤、肝癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)miR-214-5p的抗腫瘤作用[12～14]。近年來miR-214-5p在心血管疾病中的作用才逐漸被揭示。研究顯示，miR-214-5p水平的降低與胎盤生長因子水平的升高和動脈粥樣硬化的惡化有關(guān)，miR-214-5p是重度冠狀動脈疾病潛在的保護(hù)劑和生物學(xué)標(biāo)志物[15]。miR-214-5p通過靶向NCK相關(guān)蛋白1(NCK association protein 1，NCKAP1)在一定程度上抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，防止血管損傷后新生內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞增生[16]。然而，另一項研究則表明抑制miR-214-5p表達(dá)對心肌肥大和心理衰竭具有治療作用[17]。本研究顯示IFN-α干預(yù)處理促進(jìn)血管外膜成纖維細(xì)胞miR-214-5p表達(dá)，干擾miR-214-5p表達(dá)則反轉(zhuǎn)IFN-α對血管外膜成纖維細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。提示IFN-α抗血管外膜成纖維細(xì)胞作用與上調(diào)miR-214-5p表達(dá)有關(guān)。

MFGE8與人類疾病進(jìn)展密切相關(guān)，研究顯示MFGE8表達(dá)增加，個體表現(xiàn)出更高的冠狀動脈疾病風(fēng)險，抑制MFGE8表達(dá)可抑制冠狀動脈平滑肌細(xì)胞增殖，具有抗動脈粥樣硬化作用[18]。在黑色素瘤中，間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生大量的MFGE8，MFGE8促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和內(nèi)皮素1(endothelin 1，ET-1)表達(dá)，導(dǎo)致血管生成和腫瘤生長增強(qiáng)。此外，糖基化低密度脂蛋白通過下調(diào)MFGE8誘導(dǎo)大鼠視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，改善MFGE8表達(dá)對糖尿病視網(wǎng)膜病變具有保護(hù)作用[19]。本研究顯示，IFN-α干預(yù)處理顯著抑制血管外膜成纖維細(xì)胞MFGE8表達(dá)，并通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒濿estern blot法檢測證實miR-214-5p靶向負(fù)調(diào)控MFGE8表達(dá)，過表達(dá)MFGE8則反轉(zhuǎn)IFN-α對血管外膜成纖維細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。進(jìn)一步研究顯示，干擾MFGE8表達(dá)反轉(zhuǎn)抑制miR-214-5p表達(dá)對IFN-α誘導(dǎo)的人腦血管外膜成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的作用。以上研究說明IFN-α對人腦血管外膜成纖維細(xì)胞增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用與調(diào)控miR-214-5p/MFGE8通路有關(guān)。

綜上所述，IFN-α通過調(diào)控miR-214-5p/MFGE8通路抑制人腦血管外膜成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究為IFN-α在血管增生性疾病治療中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)，miR-214-5p/MFGE8有望成為血管增生性疾病的潛在治療靶點(diǎn)。