張 靜 周永剛 舒俊斌 李曉波 呂曉俊 葉汝勇 李正在

新生血管的生成在實(shí)體瘤的發(fā)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用，實(shí)體瘤生長(zhǎng)至2mm3左右就必須要新生血管長(zhǎng)入才能繼續(xù)維持腫瘤血供，血管內(nèi)皮細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)增殖并相互連接形成新生血管，為腫瘤細(xì)胞惡性增殖所必須的氧氣及營(yíng)養(yǎng)成分提供血運(yùn)通路，同時(shí)為腫瘤轉(zhuǎn)移提供了準(zhǔn)備條件。膠質(zhì)瘤作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，具有極強(qiáng)的侵襲性，當(dāng)前膠質(zhì)瘤患者的治療存在高復(fù)發(fā)率和高病死率這兩大難題，預(yù)后較差，同時(shí)膠質(zhì)瘤作為一種血供較為豐富的腫瘤，其血管新生異常旺盛[1, 2]。因此，探討膠質(zhì)瘤血管新生的分子作用機(jī)制和潛在的遺傳異常是當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題。

既往研究發(fā)現(xiàn)，miRNA作為基因組中的非編碼序列，可通過(guò)與靶基因的3′-UTR的配對(duì)從而降解或抑制靶基因mRNA的翻譯，進(jìn)而在機(jī)體發(fā)育、分化和代謝等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[3,4]。當(dāng)前研究表明，miR-130b在肺癌和甲狀腺癌等多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)下調(diào)[5,6]。同時(shí)miR-130b與胰腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7]。在結(jié)腸癌細(xì)胞中特異性上調(diào)miR-130b的表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞血管生長(zhǎng)[8]。以上研究表明miR-130b與惡性腫瘤多種惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，而miR-130b在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)和惡性生物學(xué)行為的關(guān)系尚未有研究報(bào)道。因此，本研究將探討miR-130b在膠質(zhì)瘤血管新生中的作用及具體作用機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的防治研究提供有益參考。

材料與方法

1.細(xì)胞與試劑:膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、SHG-44和U87及人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞系NHA購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司；EGM-2培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；含EDTA胰蛋白酶購(gòu)自中國(guó)吉諾公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；miR-130b及內(nèi)參U6引物和探針由廣州銳博生物公司設(shè)計(jì)合成；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購(gòu)自美國(guó)ABI 公司；miR-130b模擬物和miR-130b抑制劑及其陰性對(duì)照模擬物NC和抑制劑NC均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司；VEGFA酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和RIPA裂解液購(gòu)自北京中山生物工程公司；熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；EMSA試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；TNF-α和VEGFA抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司；β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：U251、SHG-44、U87和NHA細(xì)胞均培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，HUVECs培養(yǎng)于EGM-2培養(yǎng)基中，所有培養(yǎng)基中均添加10%的胎牛血清，細(xì)胞均置于37℃、5% CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中，當(dāng)細(xì)胞貼壁鋪滿(mǎn)80%～90%視野時(shí)，使用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化傳代。

3.細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液并調(diào)整濃度為5×106/ml，將細(xì)胞懸液接種至6孔板中，每孔100μl，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。根據(jù)LipofectamineTM2000 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，實(shí)驗(yàn)分為以下4組：①模擬物NC組：每孔U87細(xì)胞加入100nmol的模擬物NC及5μl 轉(zhuǎn)染試劑；②miR-130b模擬物組：每孔U87細(xì)胞加入100nmol的miR-130b模擬物及5μl轉(zhuǎn)染試劑；③抑制劑NC組：每孔U251細(xì)胞加入100nmol的抑制劑NC及5μl 轉(zhuǎn)染試劑；④miR-130b抑制劑組：每孔U251細(xì)胞加入100nmol的miR-130b抑制劑及5μl 轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞行PCR檢測(cè)，確定轉(zhuǎn)染效率后再進(jìn)行細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)。

4.qRT-PCR檢測(cè)miR-130b 的表達(dá)：在轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞中用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，RNA濃度由超微量分光光度計(jì)檢測(cè)，反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，設(shè)置U6作為內(nèi)參，通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算miR-130b的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

5.收集膠質(zhì)瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基(CM)：將膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%底面積時(shí)用移液器吸去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗4次，再加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基20ml，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育12h后收集上清液，以2500r/min速度下常溫離心5min，將上清液用0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾后，保存于4℃冰箱中。

6.ELISA法檢測(cè)CM中VEGFA含量:取出冷藏的CM，按照VEGFA酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)品濃度，在ELX808U酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司)上自動(dòng)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)各孔吸光度(A)值，計(jì)算出樣本CM中VEGFA的含量。

7.Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn):將Matrigel基底膠使用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基稀釋7倍，將稀釋好的基底膠均勻鋪被到Transwell上室底部，然后放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5h以促進(jìn)Matrigel凝固。待Matrigel膠完全凝固后，小心取出上室并吸去殘余液體，再加入50μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，然后再放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育0.5h。將20μl細(xì)胞懸液加入Transwell上室中，同時(shí)在Transwell下室中添加500μl含20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，然后將Transwell小室放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。將放置培養(yǎng)箱中孵育24h的Transwell小室取出，去除上室及下室中的培養(yǎng)基，用棉棒小心擦去小室底膜上的細(xì)胞，并用無(wú)菌PBS液小心清洗2遍。將Transwell上室放置在10%甲醇溶液中固定20min，用PBS液清洗3遍后再用結(jié)晶紫溶液染色15min。將Transwell上室自結(jié)晶紫溶液中取出后，使用PBS溶液清洗3遍，將Transwell上室置于載物片上，放置于倒置顯微鏡下觀察并拍照，在高倍鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野拍照并采集圖像。

8.小管形成實(shí)驗(yàn):將HUVECs接種于6孔培養(yǎng)瓶中，加入含20% FBS的EGM-2培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%底面積時(shí)用移液器吸去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗2次，加入CM培養(yǎng)24h。實(shí)驗(yàn)組設(shè)置為不同組別CM培養(yǎng)的HUVECs，對(duì)照組設(shè)置為含1% FBS的EGM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVECs。將不含胎牛血清的培養(yǎng)基和Matrigel膠放置4℃冰箱過(guò)夜預(yù)冷，待其變成膠凍狀，以1∶2的比例混合培養(yǎng)基和Matrigel膠，將250μl稀釋后的Matrigel膠加入24孔板中，再放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1h，至Matrigel膠凝固。調(diào)整HUVECs濃度為2×105/L，將0.1ml細(xì)胞懸液接種于預(yù)先鋪好基質(zhì)膠的24孔板中，再放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過(guò)夜，最后在倒置顯微鏡下觀察小管形成狀況。

9.熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè):將重組熒光素酶報(bào)告載體mut-psiCHECK-TNF-α-3′UTR或wt-psiCHECK-TNF-α-3′UTR共轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)87細(xì)胞中，再分別將miRNA-130b抑制劑或抑制劑NC轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48h后收獲細(xì)胞，按熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的方法對(duì)樣品熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)，每組樣本設(shè)5個(gè)復(fù)孔，熒光素酶相對(duì)活性=螢火蟲(chóng)熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值。

10.EMSA檢測(cè)NF-κB活性:按照EMSA試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)，使用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞后，再使用BSA法對(duì)各組細(xì)胞蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。雙鏈寡核酸NF-κB序列探針(正義鏈：5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3′,反義鏈：5′-GCCTGGGAAAGTCCCCTCAACCTGA-3′)，6.5%非變性聚丙烯酰胺凝膠100V預(yù)電泳60min，待溴酚藍(lán)泳動(dòng)為3/4全長(zhǎng)時(shí)停止電泳，再將帶正電的尼龍膜和膠同時(shí)夾入電泳轉(zhuǎn)移槽進(jìn)行印跡轉(zhuǎn)移，反應(yīng)條件為380mA轉(zhuǎn)移30min。將膜置于濾紙上吸干水分后轉(zhuǎn)移至紫外燈下交聯(lián)15min，在封閉液和平衡液中于室溫下分別反應(yīng)20min，經(jīng)化學(xué)發(fā)光和X線曝光后拍照，用Quantity One 4.6.2(BIO, RAD)軟件對(duì)圖形進(jìn)行光密度掃描，灰度值越高表示NF-κB激活程度越高。

11.Western blot法檢測(cè)蛋白表達(dá)：膠質(zhì)瘤細(xì)胞提取蛋白后經(jīng)按BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總蛋白，每份樣品使用20μg蛋白質(zhì)，使用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，在4℃下使用5%脫脂奶粉封閉過(guò)夜，硝酸纖維素膜經(jīng)一抗和二抗反應(yīng)后滴加新鮮配置的ECL化學(xué)發(fā)光液顯色、曝光和顯影。

結(jié) 果

1.miR-130b在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá):應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)膠質(zhì)瘤U251、SHG-44和U87細(xì)胞和正常星形膠質(zhì)細(xì)胞系NHA中miR-130b的表達(dá)，NHA細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)水平分別為U251、SHG-44和U87細(xì)胞的4.29、7.23和10.30倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。在3種膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中，U251細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)相對(duì)較高，而miR-130b在U87細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)較低，選擇U251和U87細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料(圖1)。

圖1 miR-130b在不同細(xì)胞株中的表達(dá)與NHA比較，*P=0.000

2.轉(zhuǎn)染miR-130b模擬物和miR-130b抑制劑對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-130b和VEGFA表達(dá)的影響:將miR-130b模擬物轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞，同時(shí)將miR-130b 抑制劑轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞48h后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)，miR-130b模擬物組U87細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)明顯高于模擬物NC組(P=0.000)，而miR-130b抑制劑組U251細(xì)胞中miR-130b的表達(dá)水平顯著低于抑制劑 NC組(P=0.000)。miR-130b模擬物和miR-130b抑制劑轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞48h后，收集膠質(zhì)瘤細(xì)胞條件培養(yǎng)基，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞CM中VEGFA的表達(dá)水平，miR-130b模擬物組U87細(xì)胞CM中VEGFA的表達(dá)明顯低于模擬物NC組(P=0.004)，而miR-130b抑制劑組U251細(xì)胞CM中VEGFA的表達(dá)水平顯著高于抑制劑NC組(P=0.000,圖2)。

3.過(guò)表達(dá)/干擾miR-130b后膠質(zhì)瘤細(xì)胞CM對(duì)體外HUVECs侵襲和小管形成的影響：為評(píng)估干擾/過(guò)表達(dá)miR-130b后膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)體外HUVECs運(yùn)動(dòng)能力的影響，筆者分別提取了轉(zhuǎn)染miR-130b模擬物和miR-130b抑制劑及其對(duì)照的細(xì)胞CM，HUVECs經(jīng)CM作用24h后進(jìn)行Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)。如圖3A所示，細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HUVECs經(jīng)miR-130b模擬物組細(xì)胞的CM處理后，侵襲出Matrigel的細(xì)胞數(shù)為14.8±2.8，顯著低于模擬物 NC組(34.5±5.9)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)；而HUVECs經(jīng)miR-130b抑制劑組細(xì)胞的CM處理后，侵襲出Matrigel的細(xì)胞數(shù)為52.8±6.5，明顯高于抑制劑NC組(30.1±4.3)，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)。

圖2 miR-130b對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中VEGFA表達(dá)的影響A.miR-130b;B.VEGFA

利用小管形成實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)過(guò)表達(dá)/干擾miR-130b的膠質(zhì)瘤細(xì)胞CM對(duì)體外HUVECs的血管生成能力，HUVECs在體外Matrigel基質(zhì)環(huán)境中生長(zhǎng)12h后，細(xì)胞逐漸向兩端延長(zhǎng)呈梭形，同時(shí)細(xì)胞延長(zhǎng)端開(kāi)始在Matrigel膠中伸展，相鄰細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)聯(lián)接并出現(xiàn)管腔樣結(jié)構(gòu)。miR-130b模擬物組細(xì)胞CM處理的HUVECs體外小管形成數(shù)為24.9±2.7，顯著低于模擬物NC組(36.7±4.5)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)；miR-130b抑制劑組細(xì)胞CM處理的HUVECs體外小管形成數(shù)為57.8±8.3，明顯高于抑制劑NC組(31.4±4.5)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002,圖3)。

圖3 miR-130b對(duì)HUVECs遷移和小管形成能力的影響A.Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)；B.小管形成實(shí)驗(yàn)

4.TNF-α是miR-130b的直接靶基因：為了研究miR-130b在膠質(zhì)瘤細(xì)胞血管新生中的可能作用機(jī)制，通過(guò)檢索miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)獲得has-miR-130b序列，并通過(guò)運(yùn)用生物信息學(xué)工具RNAhybrid 2.1、TargetScan和PicTar對(duì)miR-130b靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，TNF-α與has-miR-130b存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)(圖4A)。為此，筆者進(jìn)一步應(yīng)用熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)體外U87細(xì)胞中miR-130b對(duì)TNF-α的調(diào)控作用進(jìn)行驗(yàn)證。

熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)結(jié)果(圖4B)顯示，與共轉(zhuǎn)染wt-psiCHECK-TNF-α-3′UTR和抑制劑NC后細(xì)胞熒光素酶活性比較，在U87細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染wt-psiCHECK-TNF-α-3′UTR和miR-130b抑制劑后的熒光素酶活性值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.004)；而共轉(zhuǎn)染mut-psiCHECK-TNF-α-3′UTR和miRNA-130b抑制劑后細(xì)胞熒光素酶活性值與共轉(zhuǎn)染mut-psiCHECK-TNF-α-3′UTR和抑制劑NC后的細(xì)胞熒光素酶活性值比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miRNA-130b模擬物和miRNA-130b抑制劑分別轉(zhuǎn)染U87和U251后，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TNF-α蛋白的表達(dá)，miR-130b模擬物組U87細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)明顯低于模擬物NC組(P=0.000)，而miR-130b 抑制劑組U251細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)水平顯著高于抑制劑NC組(P=0.000，圖4C)。以上結(jié)果表明，miRNA-130b可與TNF-α的3′-UTR結(jié)合，TNF-α是miR-130b的直接靶向基因。

圖4 miR-130b對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中TNF-α和VEGFA表達(dá)的影響A.生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)靶基因；B.熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)；C.蛋白質(zhì)電泳圖

5.過(guò)表達(dá)/干擾miR-130b對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NF-κB活性及VEGFA蛋白表達(dá)的影響：將miR-130b模擬物或模擬物NC轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞，同時(shí)將miR-130b抑制劑或抑制劑NC轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞48h后，利用EMSA檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NF-κB活性，結(jié)果如圖5所示，miR-130b模擬物組U87細(xì)胞中NF-κB活性較模擬物NC組明顯減弱(P=0.000)，而miR-130b抑制劑組U251細(xì)胞中NF-κB活性顯著強(qiáng)于抑制劑NC組(P=0.000)。

miR-130b模擬物和miR-130b抑制劑轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞48h 后，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中VEGFA蛋白的表達(dá)水平， miR-130b模擬物組U87細(xì)胞中VEGFA的表達(dá)明顯低于模擬物NC組(P=0.000)，而miR-130b抑制劑組U251細(xì)胞CM中VEGFA的表達(dá)水平顯著高于抑制劑NC組(P=0.000)。

圖5 miR-130b對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中NF-κB活性的影響

討 論

目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的高級(jí)別膠質(zhì)瘤有效的治療方案是根治性手術(shù)治療配合術(shù)后放療、化療，但即便接受正規(guī)的內(nèi)外科聯(lián)合治療，其中位生存期也不超過(guò)12個(gè)月，因此，膠質(zhì)瘤的防治研究是目前神經(jīng)外科學(xué)家和基礎(chǔ)科研工作者所面臨的重任。研究表明，miRNAs在多種惡性腫瘤中扮演著致癌基因或抑癌基因的角色，同時(shí)在腫瘤轉(zhuǎn)移和血管新生中發(fā)揮著重要作用。miR-130b在多種惡性腫瘤中表達(dá)減少，同時(shí)與腫瘤進(jìn)展和預(yù)后不良相關(guān)，但miR-130b與膠質(zhì)瘤相關(guān)性研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-130b在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)較正常星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)下調(diào)，因此，需要進(jìn)一步研究miR-130b在膠質(zhì)瘤惡性生物學(xué)行為中的作用。

血管新生作為一種新生血管管腔形成的生理過(guò)程，這個(gè)過(guò)程受血管生成促進(jìn)因子和血管生成抑制因子雙重調(diào)控。既往研究表明，作為血管生成促進(jìn)因子中最重要的一種，VEGFA在促進(jìn)多種惡性腫瘤血管生成過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用[9, 10]。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的VEGFA與腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11]。此外，VEGF拮抗劑如貝伐珠單抗應(yīng)用于臨床可改善膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后[12]。本研究表明，上調(diào)miR-130b的表達(dá)可抑制體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞CM中VEGFA的表達(dá)，而下調(diào)miR-130b的表達(dá)可促進(jìn)體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞CM中VEGFA的表達(dá)。因此，筆者提出miR-130b可能對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的血管新生產(chǎn)生一定抑制作用，本研究印證了這一假設(shè)。本研究中，筆者首次發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-130b的表達(dá)對(duì)HUVECs的運(yùn)動(dòng)能力和血管生成具有抑制作用，而下調(diào)miR-130b的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞促進(jìn)血管生成的啟動(dòng)和維持過(guò)程中起到重要作用，從而表明miR-130b對(duì)膠質(zhì)瘤血管新生是必不可少的。然而，關(guān)于miR-130b如何調(diào)控血管生成以及miR-130b和VEGFA在膠質(zhì)瘤中的中間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尚不清楚。

TNF-α在大量良性疾病和惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演著關(guān)鍵調(diào)節(jié)器的作用[13]。最新證據(jù)顯示，TNF-α參與調(diào)節(jié)正常和異常的血管生成；人體血管內(nèi)皮細(xì)胞在TNF-α的作用下可促進(jìn)血管細(xì)胞黏附分子、細(xì)胞內(nèi)黏附分子和VEGFA的分泌[14]。腫瘤細(xì)胞活化的肌成纖維細(xì)胞所分泌的TNF-α可以通過(guò)誘導(dǎo)促血管生成因子的表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞外滲和血管生成[15]。然而，迄今為止尚未有miR-130-b和TNF-α的生物學(xué)功能研究報(bào)道。在筆者的研究中，下調(diào)miR-130b的表達(dá)可促進(jìn)TNF-α在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)，而TNF-α在miR-130b高表達(dá)的U251細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著降低。此外，熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，miR-130b直接靶向調(diào)控TNF-α。

研究表明，NF-κB在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，并且黏附分子和VEGF的表達(dá)與激活的NF-κB直接相關(guān)[16, 17]。TNF-α作為NF-κB的主要活化因子之一，TNF-α激活NF-κB的作用機(jī)制已有詳盡的研究[18，19]。本研究表明，miR-130b在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的異位表達(dá)可抑制NF-κB活性，而敲除miR-130b的表達(dá)可增強(qiáng)NF-κB活性。此外，筆者發(fā)現(xiàn)miR-130b的表達(dá)下調(diào)可增加NF-κB的下游基因，如VEGFA的表達(dá)。至此，筆者發(fā)現(xiàn)miR-130b與VEGFA之間的調(diào)控機(jī)制是通過(guò)TNF-α/NF-κB這一中間信號(hào)通道來(lái)實(shí)現(xiàn)，TNF-α/NF-κB信號(hào)通道可誘導(dǎo)下游促血管生成因子表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞血管新生，miR-130b/TNF-α/NF-κB/VEGFA信號(hào)通路可能在調(diào)控膠質(zhì)瘤血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

綜上所述，本研究強(qiáng)調(diào)了miR-130b和VEGFA之間的相互作用的重要性，miR-130b可直接靶向調(diào)控 TNF-α，從而進(jìn)一步調(diào)控NF-κB信號(hào)通道而控制膠質(zhì)瘤血管生成。從機(jī)制上看，下調(diào)miR-130b可促進(jìn)TNF-α的高水平表達(dá)，并有助于NF-κB激活和其下游基因VEGFA的表達(dá)。這樣，miR-130b/TNF-α/NF-κB/VEGFA通路可能是未來(lái)膠質(zhì)瘤治療的具體作用靶點(diǎn)，從而在揭示膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制及治療上具有一定積極意義。