楊瀾波 鄒春雨 米豫飛 王戰(zhàn)朝 史占軍 黃 濤

骨肉瘤起源于成骨細(xì)胞，是最常見的運(yùn)動系統(tǒng)惡性腫瘤，多見于膝關(guān)節(jié)周圍，占青少年骨腫瘤的56%，其特點(diǎn)是全身轉(zhuǎn)移快及局部侵襲強(qiáng)[1～3]。雖然越來越多的新方法被用于骨肉瘤的診斷和治療，但自20世紀(jì)90年代以來，骨肉瘤的總體生存率并沒有提高[4]。通過大劑量化療來克服腫瘤耐藥的同時常伴隨著嚴(yán)重的不良事件，如嚴(yán)重的骨髓抑制和其他器官毒性，甚至可能危及生命[5]。如何實(shí)現(xiàn)有效治療腫瘤的同時盡可能降低化療藥物的不良反應(yīng)，是當(dāng)前研究的一個熱點(diǎn)。隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，人們逐漸開始關(guān)注骨肉瘤的靶向化療[6]。

血管可以為腫瘤細(xì)胞輸送營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，若無足夠的新生血管，腫瘤就無法生長[7]。因此，腫瘤內(nèi)的血管系統(tǒng)可作為治療腫瘤的一個有效靶點(diǎn)[8]。腫瘤血管靶向藥物為腫瘤治療提供了一個非細(xì)胞毒性的新途徑。噬菌體展示技術(shù)是一種高效獲取全新生物活性肽的實(shí)用技術(shù)[9]。將噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用于尋找特異結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的短肽，為開發(fā)新的腫瘤血管靶向肽類藥物提供了新的方向。在之前的研究中，筆者已經(jīng)利用噬菌體展示技術(shù)，篩選出了能與OAVECs靶向結(jié)合7肽TY-7，并證實(shí)表達(dá)此7肽的噬菌體能特異性結(jié)合OAVECs。本研究通過合成該肽，在體外細(xì)胞水平驗(yàn)證了其與OAVECs結(jié)合的特異性，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動物與材料：3周齡SPF級BALB/c-nu裸鼠，體質(zhì)量13.8±0.7g，購自南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，SPF級動物房飼養(yǎng)，模擬正常晝夜節(jié)律光照，自由飲食。骨肉瘤UMR-106細(xì)胞株購自中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)，DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶/0.02%乙二胺四乙酸(0.25% Trypsin/0.02% EDTA)、Ⅱ型膠原酶、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)及新生小牛血清(newborn calf serum，NBCS)購自美國Gibco公司，Ⅰ型鼠尾膠原購自廣州威佳公司，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)購自上?；蚬荆辜?xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原兔多抗工作液、羊抗兔IgG、抗生物素-過氧化物酶(ABC)及DAB試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，青霉素及鏈霉素購自華北制藥有限公司。側(cè)鏈保護(hù)的20種L型9-芴基甲氧羰基(Fmoc)氨基酸、1-羥基苯并三唑(HOBt)、固相載體 9-芴基甲氧羰基亮氨酰-2-氯三苯基(Fmoc-Leu-2-Cl-Trt resin)樹脂、N,N′-異丙基碳二亞胺(DIC)購自廣州百奧肽公司，異硫氰酸熒光素(FITC)購自美國Sigma公司。

2.OAVECs特異性結(jié)合肽的合成及純化：采用Fmoc固相合成TY-7，使用制備型高效液相儀分離純化后于N端標(biāo)記一個FITC基團(tuán)。FITC-TKPDKGY(FITC-TY-7)成品使用檢測型HPLC儀和質(zhì)譜儀進(jìn)行分析鑒定。

3.UMR-106細(xì)胞的培養(yǎng)和骨肉瘤動物模型的構(gòu)建：UMR-106細(xì)胞使用含10% NBCS的RPMI1640培養(yǎng)基，在飽和濕度、95%O2和5%CO2及恒溫37℃的條件下常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的UMR-106細(xì)胞，用胰酶消化后，PBS漂洗兩遍，使用無血清RPMI1640培養(yǎng)基制成濃度為108/ml的動物模型接種細(xì)胞懸液。選取健康活躍裸鼠，消毒后于裸鼠左側(cè)腋下皮下注射UMR-106細(xì)胞懸液0.1ml。造模1周后即可成瘤，3周后腫瘤直徑可達(dá)1cm。

4.原代培養(yǎng)：正常血管內(nèi)皮細(xì)胞：頸椎脫臼處死裸鼠，無菌條件下迅速打開胸腹腔取出主動脈，PBS液沖凈血液，剝除血管周圍結(jié)締組織，加入膠原酶37℃消化30min。收集消化后的液體離心(1000r/5min)棄上清，加入培養(yǎng)基(低糖型DMEM、20%FBS、15U/ml肝素、2ng/ml VEGF、青霉素100U/ml、鏈霉素100U/ml)重懸沉淀后種植于Ⅰ型鼠尾膠原包被的培養(yǎng)皿中。2h后待內(nèi)皮細(xì)胞貼壁后換液去除污染的成纖維細(xì)胞。待細(xì)胞生長分裂融合成單層、鋪滿皿底后傳代。骨肉瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞：在無菌條件下，將荷瘤裸鼠頸椎脫臼處死切取腫瘤，顯微鏡下分離腫瘤內(nèi)血管，后續(xù)處理與原代培養(yǎng)正常血管內(nèi)皮細(xì)胞相同。

5.血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫組化鑒定：取生長良好的OAVECs、AECs細(xì)胞爬片，漂洗后使用4%多聚甲醛固定15min。再次漂洗后加入3%H2O2封閉10min。非免疫血清室溫孵育10min，洗片后加入50μl一抗(兔源抗Ⅷ因子相關(guān)抗原多抗工作液)4℃過夜。再次洗片后加入50μl二抗(生物素標(biāo)記羊抗兔IgG工作液)溫育30min。最后洗片2次后加入ABC溶液37℃孵育15min，DAB試劑盒顯色。空白對照組使用PBS液代替一抗。封片置于鏡下觀察3個代表性視野，計數(shù)100個細(xì)胞得出陽性率。

6.FITC-TY-7與OAVECs特異性結(jié)合的檢測：(1)熒光顯微鏡：取生長良好的UMR-106、AECs及OAVECs細(xì)胞爬片，漂洗固定后避光加入5μmol/L的FITC-TY-7，37℃孵育30min。充分漂洗、中性甘油封片后熒光顯微鏡觀察。另取OAVECs與單純FITC基團(tuán)作用作為對照組。(2)流式細(xì)胞儀：取生長良好的UMR-106、AECs及OAVECs細(xì)胞懸液分別加入流式細(xì)胞儀上樣管，離心棄上清后加入1～2滴PBS液稀釋。每種細(xì)胞均分別避光加入FITC-TY-7、單純FITC基團(tuán)和PBS液室溫孵育30min。最后，PBS液稀釋至上樣管的2/3，輕振試管后再次離心棄上清，固定后檢測。

結(jié) 果

1.FITC-TY-7的合成純化：FITC-TY-7的純度為98.71%，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定并測定相對分子質(zhì)量為1197.3(圖1)。

圖1 FITC-TY-7質(zhì)譜鑒定結(jié)果圖

2.原代培養(yǎng)：腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞于種植后第4天即可見到明顯的內(nèi)皮細(xì)胞集落，正常血管內(nèi)皮細(xì)胞則第6天可見細(xì)胞集落。OAVECs和AECs形態(tài)上無明顯差別，呈多角形、短梭形或不規(guī)則形，核清晰，呈橢圓形或圓形。兩種細(xì)胞均生長迅速，約7～9天后細(xì)胞匯合即生長減緩。傳至3～4代時，細(xì)胞開始逐漸不再貼壁，數(shù)目減少，停止生長，變性變形直至死亡。

3. 免疫組化鑒定：Ⅷ因子免疫組化顯示AECs和OAVECs胞質(zhì)均呈黃褐色著色，AECs陽性細(xì)胞率為97.3%，OAVECs陽性細(xì)胞率為98.7%，而陰性對照組無特殊顯色(圖2)。

圖2 AECs和OAVECs的Ⅷ因子免疫組化鑒定(×200)

4.FITC-TY-7與OAVECs特異性結(jié)合的檢測：(1)熒光顯微鏡：OAVECs與FITC-TY-7作用后細(xì)胞表面熒光較強(qiáng)且清晰，顯示明確結(jié)合；而AECs及UMR-106與FITC-TY-7作用后熒光微弱模糊且與背景熒光一致，可認(rèn)為此兩種細(xì)胞與FITC-TY-7無特異性結(jié)合(圖3)。(2)流式細(xì)胞儀：OAVECs與FITC-TY-7作用時，熒光標(biāo)記的陽性細(xì)胞比例達(dá)89.54%；而AECs和UMR-106與FITC-TY-7作用時，熒光標(biāo)記細(xì)胞比例分別為0.27%和0.22%(圖4)。單純FITC基團(tuán)分別與3種細(xì)胞作用時，熒光標(biāo)記細(xì)胞比例均<1.00%。

圖3 FITC-TY-7作用后熒光顯微鏡成像(×100)

圖4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞與FITC-TY-7的結(jié)合

討 論

血管在惡性腫瘤進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用，腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)時必須打開“血管生成開關(guān)”，才能誘導(dǎo)腫瘤生長至1～2mm[10]。幾乎所有的惡性腫瘤都具有持續(xù)的血管生成能力，這是侵襲性的重要基礎(chǔ)[7]。近年來，傳統(tǒng)細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物的獲得性耐藥引發(fā)了對更具針對性的新治療策略的探索，腫瘤微環(huán)境被認(rèn)為是重要的潛在治療靶點(diǎn)，其中最關(guān)鍵的是抗血管治療[11]。從傳統(tǒng)的以腫瘤細(xì)胞為中心的治療策略轉(zhuǎn)向抗血管治療模式，開辟了腫瘤治療的新領(lǐng)域[12]。腫瘤抗血管治療并不是直接通過細(xì)胞毒性針對腫瘤細(xì)胞，而是通過破壞血管實(shí)現(xiàn)阻斷氧氣、生長因子和營養(yǎng)的供應(yīng)[13]。越來越多的研究表明，抗血管藥物以腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞為攻擊目標(biāo)，直接針對已建立但異常的腫瘤血管系統(tǒng)，以腫瘤優(yōu)先的方式迅速阻斷血流，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)快速廣泛的缺氧和腫瘤細(xì)胞死亡[14]。腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞基因穩(wěn)定性較好，同質(zhì)性強(qiáng)，標(biāo)志物穩(wěn)定，可以有效避免耐藥。另外，靜脈應(yīng)用抗血管藥物可直接作用于腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而提高藥效，降低耐藥性，減少不良反應(yīng)[15]。與傳統(tǒng)治療方法比較，直接靶向腫瘤血管可以應(yīng)用于多種腫瘤，在數(shù)小時內(nèi)達(dá)到治療效果[16]。

多項(xiàng)研究證實(shí)通過血栓形成選擇性阻斷腫瘤血管可有效地殺死腫瘤，延長晚期患者的生存期[13,17]。在過去的幾十年里，已經(jīng)開發(fā)出數(shù)種專門阻斷腫瘤血管的治療方法，可在數(shù)小時或數(shù)天內(nèi)破壞腫瘤血管系統(tǒng)，降低血管密度，抑制腫瘤血流，導(dǎo)致廣泛的腫瘤壞死[18～20]。血管靶向化療有望為惡性腫瘤治療帶來革命性的變化，但是如何尋找特異性結(jié)合腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的基團(tuán)至關(guān)重要。Bussolati等[21]通過噬菌體展示技術(shù)獲得了親和腎腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的噬菌體克隆CVGNDNSSC，根據(jù)序列合成短肽并證實(shí)該肽可特異性結(jié)合腎腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞而不與正常血管及其他腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合。Arap等[22]同樣利用噬菌體展示技術(shù)得到了能與前列腺腫瘤血管靶向結(jié)合的短肽SMSIARL。而Sharma等[23]則更進(jìn)一步，把腫瘤血管導(dǎo)敏肽(CGKRK)與促凋亡肽(KLAKLAK)結(jié)合制成納米顆粒，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤和乳腺癌的治療中顯示出良好的效果。

骨肉瘤生長侵襲嚴(yán)重依賴血管的形成，針對腫瘤血管系統(tǒng)的治療具有廣闊的前景，有望成為克服傳統(tǒng)大劑量化療弊端的新策略。為得到可特異性結(jié)合OAVECs的低分子基團(tuán)，管明強(qiáng)等[24]利用噬菌體展示技術(shù)獲取了能靶向結(jié)合UMR-106荷瘤裸鼠腫瘤血管的噬菌體(TKPDKGY)，并通過該單克隆噬菌體初步驗(yàn)證了其結(jié)合的特異性。本研究中，筆者進(jìn)一步根據(jù)此噬菌體的序列合成了短肽TY-7并標(biāo)記FITC，在體外細(xì)胞水平通過熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀對其與OAVECs的結(jié)合特異性進(jìn)行了驗(yàn)證。熒光顯微鏡顯示TY-7可靶向結(jié)合OAVECs，但與正常血管內(nèi)皮細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞無明顯結(jié)合。流式細(xì)胞儀則進(jìn)一步證實(shí)TY-7與OAVECs結(jié)合率(89.54%)遠(yuǎn)高于與UMR-106(0.27%)和AECs(0.22%)，說明TY-7能高度與OAVECs特異性結(jié)合。以上實(shí)驗(yàn)通過定性和定量兩方面驗(yàn)證了TY-7具備與OAVECs靶向結(jié)合的能力，同時并不與骨肉瘤細(xì)胞及裸鼠正常血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合。

在靶向診療的研究中，能否得到可高選擇性結(jié)合靶點(diǎn)的基團(tuán)至關(guān)重要。本研究中由噬菌體展示技術(shù)獲得的短肽TY-7具有在體外細(xì)胞水平高度特異結(jié)合OAVECs的能力。在此基礎(chǔ)上，筆者將進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)TY-7與效應(yīng)分子結(jié)合，研究其對骨肉瘤的靶向治療作用，或與造影劑結(jié)合，評價其診斷示蹤作用，為骨肉瘤血管靶向診療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。