巨嘯晨 舒 莉 周 玲 孫榮鑫

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，起源于骨髓間充質(zhì)干細胞，其特點是進展迅速且預后不良[1,2]。OS主要發(fā)生在兒童和青少年期，據(jù)報道，年齡15～19歲的發(fā)生率最高，為每年800萬～1100萬，5年生存率為60%～70%[3，4]。一些患者在確診時即可出現(xiàn)轉(zhuǎn)移性病灶，另外還有一些無法辨別的亞臨床癥狀的微小轉(zhuǎn)移， 致使該病的治療效果不甚理想[5，6]。目前，OS的主要治療手段是手術(shù)并輔以放療和化療[7,8]。近年來，盡管外科手術(shù)方法有所改善，但骨肉瘤患者的生存率并沒有得到明顯提高，復發(fā)和轉(zhuǎn)移的概率仍然較大。因此，進一步探索OS發(fā)展的機制并尋找治療骨肉瘤治療的新方法是十分迫切的。

細胞周期蛋白依賴性激酶活化激酶 (cyclin dependent kinase-activating kinase，CDK) 通過調(diào)控細胞周期在細胞形成以及增殖過程中具有重要作用[9]。CDK的磷酸化由CDK激活激酶(CAK)執(zhí)行的，CAK是由CDK7、細胞周期蛋白H和輔助蛋白MAT1組成的三聚體復合物[10]。其中，MAT1作為CAK的重要組成部分，在多數(shù)癌細胞中過度表達，并參與癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移等生物學行為[11]。有研究表明，MAT1的缺失會阻礙抑癌蛋白的磷酸化并誘導骨肉瘤細胞中的G1阻滯，說明MAT1可能在骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展中起到了一定的作用[12]。本研究通過RNAi 技術(shù)沉默骨肉瘤細胞143B細胞中MAT1的表達，旨在探討沉默MAT1 表達后對143細胞增殖、遷移的影響，并揭示其潛在機制。

材料與方法

1.主要試劑與材料：人骨肉瘤細胞株Saos-2、MG63、U2OS、143B與人成骨細胞hFOB1.19購自美國美國菌種保藏中心ATCC。本研究主要試劑包括TRIzol試劑與LipofectamineTM 2000 購自美國Invitrogen 公司，胎牛血清、100U/ml 青霉素和100μg/ml鏈霉素、DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司，RNase和PI試劑購自江蘇凱基公司，TRIzol試劑、Prime ScriptTMRT reagent Kit試劑盒以及SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均購自日本TaKaRa公司，CCK-8試劑盒、RIPA 裂解液與BCA蛋白測定試劑盒均購自美國 Bio-Rad 公司，Transwell 小室購自美國 Costar公司。

2.細胞培養(yǎng)：將骨肉瘤細胞株Saos-2、MG63、U2OS、143B以及人成骨細胞hFOB1.19置于含有10%胎牛血清、100U/ml 青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃的細胞恒溫培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。當細胞密度達到 80%～90%時，加0.25%胰蛋白酶消化傳代。本研究所有細胞均為生長良好的第3代對數(shù)生長期細胞。

3.qRT-PCR：使用TRIzol試劑從各細胞系(hBMSCs、hFOB1.19、Saos-2、MG63和U2OS)中提取總RNA。按照Prime ScriptTM RT Reagent Kit說明書進行反轉(zhuǎn)錄操作獲得cDNA。根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ說明并以GAPDH 作為內(nèi)參基因檢測MAT1 mRNA的表達。擴增體系：上游引物1μl、下游引物1μl、cDNA 2μl、SYBR Premix Ex TaqⅡ 12.5μl、無酶水補足25μl。擴增條件：95℃ 3min，95℃ 30s，60℃ 30s，58℃ 30s，40個循環(huán)。使用2-ΔΔCt法來計算MAT1 mRNA的相對表達量。使用的引物由上海生工生物有限公司合成，具體序列如下：MAT1上游引物：5′-ACTGCCCTGAGTGTGGTACT-3′，下游引物：5′-TGAAATATGTTGACCCAGCTCATCT-3′；GAPDH上游引物：5′-TTTGCGTCGCCAGGTGAAGA-3′，下游引物：5′-AGTTAAAAGCAGCCCTGGTGA-3′。

4.siRNA 轉(zhuǎn)染：將143B細胞以 2×105個/孔的密度接種于 6 孔板中進行培養(yǎng)，細胞密度達到70%左右時進行轉(zhuǎn)染。細胞分為空白對照組(正常培養(yǎng)，不進行轉(zhuǎn)染)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染陰性對照 siRNA-NC)和 siRNA-MAT1 組(轉(zhuǎn)染 siRNA-MAT1)，siRNA序列由上海生工生物有限公司設(shè)計并合成。根據(jù) Lipofectamine TM 2000 說明書操作，分別將 5μg siRNA 與 250μl OPTI-MEM、10μl 脂質(zhì)體與250μl OPTI-MEM輕柔混勻，室溫孵育10min，然后將兩種稀釋物混合均勻，室溫孵育20min。將混合后的轉(zhuǎn)染試劑加入培養(yǎng)的細胞中，在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育 6h，棄原培養(yǎng)基，更換為DMEM新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)。

5.CCK-8測定：轉(zhuǎn)染后48h，將各組143B細胞以1×104個/孔的密度接種到96孔板中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)孵育。使用CCK-8試劑盒檢測細胞的增殖力，分別于24、48、72、96h時，每孔加10μl CCK-8溶液，再將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h，在酶標儀上450nm 處檢測各孔吸光光度值。

6.流式細胞術(shù)：轉(zhuǎn)染后48h，收集各組143B細胞用于細胞周期分析。使用PBS洗滌細胞，在4℃的75%乙醇中固定24h，去除乙醇，PBS洗滌重懸細胞，加10μl RNase在37℃下孵育10min，再加入5μl PI 37℃避光孵育30min，過300目篩網(wǎng)，使用流式細胞儀檢測細胞周期。

7.Transwell小室：轉(zhuǎn)染后48h，將各組143B細胞以2×104個/孔的密度接種于Transwell 小室的上室，并加100μl 無血清培養(yǎng)基，下室中加入600μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24h后取出小室，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌，置于40g/L甲醛中固定20min，0.1%結(jié)晶紫染色30min，PBS再次洗滌，棉簽擦拭掉上層未穿過基膜的細胞，封片后使用倒置顯微鏡觀察拍照并計數(shù)。

8.Western blot法檢測：轉(zhuǎn)染后48h，使用 RIPA 裂解液抽提各組143B細胞總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。取20μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，分離的蛋白切膠并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，分別加入兔抗SDF-1(1∶500)、兔抗CXCR4(1∶500)、鼠抗β-actin(1∶1000)于4℃孵育過夜，次日使用PBS洗滌3次，每次10min，再用加HRP標記的山羊抗兔IgG(1∶5000)室溫孵育2h，PBS洗滌3次，每次10min，在暗室用ECL發(fā)光液檢測，用掃描儀掃描X線片，用ProtParam 軟件對灰度值進行分析，計算蛋白相對表達量。

結(jié) 果

1.MAT1在骨肉瘤細胞中高表達：qRT-PCR檢測MAT1 mRNA在骨肉瘤細胞株Saos-2、MG63、U2OS、143B以及人成骨細胞hFOB1.19中的表達水平。與hFOB1.19細胞比較，Saos-2、MG63、U2OS細胞中MAT1 mRNA的表達水平均明顯升高(P<0.01)，其中143B細胞中MAT1 mRNA的表達水平顯著升高(P=0.000，圖1)。選擇143B細胞進行后續(xù)實驗。

圖1 qRT-PCR檢測細胞MAT1 mRNA表達水平與hFOB1.19細胞比較，*P<0.01，**P=0.000

2.沉默MAT1對骨肉瘤細胞143B增殖的影響：qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后各組143B細胞中MAT1 mRNA的表達水平，與Blank組比較，siRNA-NC組MAT1 mRNA的表達水平無顯著變化，而siRNA-MAT1組MAT1 mRNA的表達水平較Blank組和siRNA-NC組明顯下降(P<0.01，圖2)，表明轉(zhuǎn)染siRNA成功。CCK-8檢測在轉(zhuǎn)染143B細胞后24、48、72、96h時細胞的增殖能力，轉(zhuǎn)染siRNA-MAT1的細胞增殖活性較低，在72h時siRNA-MAT1組細胞增殖活力顯著低于Blank組和siRNA-NC組(P<0.01，圖3)。利用流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后各組143B細胞的周期變化，Blank組和siRNA-NC組中細胞G1期比例分別為48.22%、47.89%，S期比例為32.41%、30.67%。而siRNA-MAT1組細胞G1期比例增加，達到60.23%， S 期比例下降至23.55%(圖4)。

圖2 qRT-PCR檢測各組轉(zhuǎn)染143B細胞MAT1 mRNA表達與Blank組比較，*P<0.01;與siRNA-NC組比較，#P<0.01

圖3 CCK-8檢測各組轉(zhuǎn)染143B細胞增殖活力與Blank組比較，*P<0.01；與siRNA-NC組比較，#P<0.01

3.沉默MAT1對骨肉瘤細胞143B遷移的影響：通過Transwell 小室法對轉(zhuǎn)染后各組143B細胞的遷移能力進行分析，siRNA-MAT1組143B細胞遷移的細胞數(shù)目明顯低于對照組和siRNA-NC組(P<0.01)，而siRNA-NC組較Blank組細胞遷移的細胞數(shù)目無顯著變化(圖5)。

圖4 流式細胞術(shù)檢測各組轉(zhuǎn)染143B細胞周期變化

4.沉默MAT1對骨肉瘤細胞143B中 SDF-1/CXCR4信號通路的影響：Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后各組143B細胞中SDF-1與CXCR4蛋白表達情況，siRNA-NC組SDF-1和CXCR4蛋白表達水平較Blank組無顯著變化，而沉默143B細胞中MAT1的表達后，細胞中SDF-1與CXCR4蛋白表達相對于Blank組和siRNA-NC組細胞均顯著降低(P<0.01)，詳見圖6。

圖6 Western blot法檢測各組轉(zhuǎn)染143B細胞SDF-1與CXCR4蛋白表達與Blank組比較，*P<0.01；與siRNA-NC組比較，#P<0.01

討 論

惡性腫瘤轉(zhuǎn)移是導致OS患者治療失敗的主要原因[13]。深入研究骨肉瘤的發(fā)病機制并尋找新型治療方法，這對提高OS臨床治療效果是至關(guān)重要的。而骨肉瘤的發(fā)病機制與許多基因的途徑相關(guān)，因此，探討骨肉瘤中相關(guān)基因改變的研究將有助于理解其轉(zhuǎn)移的分子機制并確定潛在的治療靶標。

MAT1基因編碼的蛋白質(zhì)可以通過蘇氨酸磷酸化來激活與細胞周期蛋白相關(guān)的激酶[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)，MAT1在細胞增殖、分化和胚胎發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用[11,14]。例如，Liu等[15]通過用siRNA或重組腺病毒轉(zhuǎn)染敲除MAT1后，研究表明人胰腺癌的細胞增殖力明顯降低并誘導了G0/G1期的阻滯。Fejzo等[16]揭示了ADRM1的過表達增強了卵巢癌ES2細胞的增殖和遷移能力，而MAT1的表達也升高，這表明MAT1可能參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移。本研究RT-PCR檢測結(jié)果顯示，MAT1在骨肉瘤細胞株Saos-2、MG63、U2OS以及143B中均高表達，這也提示MAT1可能與骨肉瘤的發(fā)生有關(guān)。RNAi技術(shù)是分子生物學研究中干擾基因表達以及研究基因功能的基因調(diào)控手段，能夠與靶基因在特定區(qū)域特異性結(jié)合來切割 mRNA 使靶基因降解[17]。本研究通過RNAi 技術(shù)沉默骨肉瘤143B細胞中MAT1的表達檢測其對143B增殖和遷移的影響。沉默143B細胞中MAT1的表達后，通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)在24、48、72、96h細胞增殖能力均受到抑制，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示細胞G1期比例增加而S 期比例下降，Transwell小室細胞遷移實驗結(jié)果顯示細胞遷移率明顯下降。說明沉默MAT1表達能夠抑制 143B細胞增殖與遷移，并阻滯細胞周期進程。

基質(zhì)細胞衍生因子-1 (SDF-1)及其特異性趨化因子受體4(CXCR4)在肺癌、大腸癌、乳腺癌及甲狀腺癌等多種腫瘤實質(zhì)細胞中廣泛表達，并在惡性腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲與遷移等過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[18～21]。兩者特異性結(jié)合發(fā)生空間構(gòu)象改變，與此同時，通過活化與其偶聯(lián)的G蛋白并激活多條信號轉(zhuǎn)導通路，以產(chǎn)生相關(guān)聯(lián)的生物學效應(yīng)。Liao等[22]通過在體外和小鼠實驗研究發(fā)現(xiàn)，AMD3100通過抑制JNK和Akt通路降低了CXCR4介導的骨肉瘤轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果證實，沉默MAT1表達也能夠抑制骨肉瘤143B細胞中SDF-1與CXCR4蛋白表達。但其激活作用或共同參與這一過程的其他信號通路有待于進一步研究。

綜上所述，MAT1與骨肉瘤的發(fā)展進程關(guān)系密切，通過本研究表明沉默MAT1表達可以抑制骨肉瘤143B細胞的增殖與遷移、阻滯細胞周期進程，機制可能與下調(diào) SDF-1與CXCR4表達有關(guān)。