宋 晨 王春蓮 趙麗榮 王箴言 戴紅英

卵巢癌發(fā)生率較高，是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，癌癥致死率位居第8位[1]。每年約有24萬女性被診斷患有卵巢癌，5年生存率約為45%，嚴重威脅女性生命健康[2,3]。Engrailed-2(EN2)基因是同源異型盒基因家族的成員之一，在胚胎和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起著重要的作用[4]。既往研究表明，EN2基因在多種類型的惡性腫瘤中均有高表達，包括前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌及卵巢癌[5～8]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，EN2可作為Wnt信號通路的關(guān)鍵性信號之一，參與調(diào)控細胞分化，并能通過調(diào)控Wnt信號轉(zhuǎn)導通路中β-連環(huán)蛋白(β-catenin)調(diào)控細胞增殖[9]。本研究通過免疫組化法檢測了EN2、β-catenin在卵巢癌、交界性腫瘤、良性腫瘤及正常卵巢組織中的表達，旨在探究EN2、β-catenin蛋白在卵巢癌組織中的表達水平及其與患者臨床病理學的相關(guān)性。

資料與方法

1.研究對象：收集筆者醫(yī)院2012年1月～2013年12月收治的卵巢腫瘤患者的病例資料共110例，其中卵巢癌60例，交界性腫瘤28例，良性腫瘤22例，患者年齡45～70歲，平均年齡50.5歲。所有患者均為首發(fā)病例，在術(shù)前均未接受過化療或放療，術(shù)后均經(jīng)病理檢查進一步診斷確診，且所有患者病歷資料完整。此外，收集同期因子宮良性病變行卵巢切除術(shù)的20例正常卵巢組織作為對照組。臨床病理分期按照國際婦產(chǎn)科協(xié)會(International Federation Of Gynecology And Obstetrics, FIGO)2009年分期標準，卵巢癌臨床早期Ⅰ～Ⅱ期20例，Ⅲ～Ⅳ期40例；分化程度：高分化(G1)17例、中分化(G2)12例，低分化(G3)31例；發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者43例；漿液性腺癌43例，黏液性腺癌17例。正常對照組年齡45～68歲，平均年齡52.4歲。

2.免疫組化法檢測：對所有病理組織進行石蠟包埋，將所有石蠟包埋后的病理組織進行連續(xù)切片，切片厚度4μm，展開切片后在玻片上進行貼片，脫蠟修復后，滴加一抗后室溫孵育1～2h，洗滌后滴加二抗，室溫孵育15～20min，洗滌后DAB顯色5min，蘇木精復染細胞核30s，脫水后封片。

3.結(jié)果判定：以細胞質(zhì)出現(xiàn)淡黃色至棕黃色或棕褐色為細胞染色陽性，綜合陽性細胞數(shù)及染色強度判斷，0～4分為EN2或β-catenin染色陰性，5～12分為EN2或β-catenin染色陽性，以陰性表達為低表達，陽性表達為高表達。低倍鏡下觀察整張切片，高倍鏡下隨機選取5個視野計數(shù)陽性細胞數(shù)。所有染色結(jié)果均由兩名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生采用雙盲法在光鏡下進行觀察。

結(jié) 果

1.EN2蛋白在不同卵巢組織中的表達情況：免疫組化結(jié)果顯示，EN2表達于細胞質(zhì)內(nèi)且在所有的檢測樣本中均有表達(圖1)，卵巢癌組織及交界性腫瘤組織EN2陽性表達率明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表1)。

圖1 EN2及β-catenin蛋白在不同卵巢組織中的表達情況(免疫組化，×200)

表1 不同組織中EN2蛋白表達情況[n(%)]

與對照組比較，*P<0.05

2.β-catenin蛋白在不同卵巢組織中的表達情況：免疫組化結(jié)果顯示，β-catenin表達于細胞質(zhì)內(nèi)且在所有的檢測樣本中均有表達(圖1)，卵巢癌組織及交界性腫瘤組織β-catenin陽性表達率明顯高于正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表2)。

表2 不同組織中β-catenin蛋白表達情況[n(%)]

與對照組比較，*P<0.05

3.EN2蛋白表達與卵巢癌臨床病理特征之間的關(guān)系：EN2蛋白的陽性表達與患者年齡、卵巢癌病理類型無顯著相關(guān)性(P>0.05)；EN2蛋白在低分化卵巢癌組織中的陽性表達率明顯高于高分化組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；EN2蛋白在早期(Ⅰ～Ⅱ)卵巢癌中的陽性表達率與晚期(Ⅲ～Ⅳ)卵巢癌比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；EN2蛋白淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移卵巢癌中的陽性表達率與未轉(zhuǎn)移的卵巢癌比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表3)。

表3 EN2表達與臨床病理特征相關(guān)情況[n(%)]

與高分化比較，*P<0.05

4.β-catenin蛋白表達與卵巢癌臨床病理特征之間的關(guān)系：β-catenin的陽性表達與患者年齡、卵巢癌病理類型無顯著相關(guān)性(P>0.05)；β-catenin蛋白在低分化卵巢癌中的陽性表達率明顯高于高分化組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；β-catenin蛋白在早期(Ⅰ～Ⅱ)卵巢癌中的陽性表達率與晚期(Ⅲ～Ⅳ)卵巢癌比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；β-catenin蛋白淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移卵巢癌中的陽性表達率與未轉(zhuǎn)移的卵巢癌比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，表4)。

表4 β-catenin表達與臨床病理特征相關(guān)情況[n(%)]

5.EN2與β-catenin表達的相關(guān)性分析：Spearman等級相關(guān)性分析結(jié)果顯示，EN2、β-catenin在卵巢癌中的表達呈正相關(guān)(P<0.05)，詳見表5。

表5 EN2與β-catenin之間的相關(guān)性[n(%)]

討 論

卵巢癌5年生存率低、預后差,因此，明確卵巢癌的發(fā)病機制、探索有效的治療手段尤為重要。同源異型盒基因(homeobox，HOX)作為轉(zhuǎn)錄因子，可與特定的DNA區(qū)域結(jié)合，激活或抑制靶基因的表達，進而參與細胞凋亡、運動與分化、血管生成和器官功能維持等多種生物學過程[10～12]。EN2基因?qū)儆贖OX家族，在人類胚胎期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用[13～15]。有報道指出，EN2可能在胚胎的早期發(fā)育和神經(jīng)系統(tǒng)功能的維持中起著重要作用，并且與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育缺陷和自閉癥的發(fā)展密切相關(guān)[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，EN2與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，在某些類型的癌癥中可能充當腫瘤抑制基因[16,17]。Martin等[6]報道，乳腺癌細胞中EN2的表達上調(diào)，可能促進了腫瘤細胞的增殖。Bose等[18]研究顯示，前列腺癌細胞系中的EN2表達水平上調(diào)，而EN2表達的沉默可能通過下調(diào)PAX2基因表達來抑制前列腺癌細胞的增殖。McGrath等[8]對8種上皮性卵巢癌細胞株及100例術(shù)后卵巢癌組織中EN2的表達水平進行了研究分析，結(jié)果顯示卵巢癌細胞系及漿液性卵巢癌癌癥組織中EN2 mRNA表達水平明顯高于正常對照組，提示EN2可能有一定的預測價值。Wnt/β-catenin信號是經(jīng)典Wnt通路，通過激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達，調(diào)控細胞生長。李云飛等[19]研究發(fā)現(xiàn)，EN2及β-catenin在同一種癌癥中的表達均明顯增高，說明EN2可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，EN2及β-catenin在卵巢癌中的表達明顯增加，這與McGrath等[8]的研究結(jié)果一致，表明EN2及β-catenin的高表達可能與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。本研究EN2及β-catenin的表達與卵巢癌的分化程度顯著相關(guān)，但與患者年齡、卵巢癌類型、臨床病理分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，提示EN2及β-catenin蛋白可能與卵巢癌的浸潤、進展、轉(zhuǎn)移無關(guān)。本研究EN2及β-catenin的表達與卵巢癌的病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)性，但有相關(guān)性趨勢(P=0.08)，其原因可能與樣本量少有關(guān)。今后的研究中需進一步收集病理數(shù)據(jù)，探究EN2及β-catenin的表達與病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果表明，卵巢癌組織中EN2與β-catenin的蛋白表達呈正相關(guān)，二者均與組織學分級顯著相關(guān)，推測EN2與β-catenin在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過程中存在協(xié)同作用。

綜上所述，卵巢癌組織中EN2及β-catenin蛋白表達明顯增高，并與病理分化程度呈正相關(guān)，提示EN2及β-catenin可能在卵巢癌的發(fā)生過程中作為腫瘤促進因子發(fā)揮生物學作用。