戴梓茹，吳遠(yuǎn)清，張晨曉，梁東萍，覃柳英

（1.廣西高校北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州535011；2.北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院，廣西欽州535011）

0 引 言

牡蠣是北部灣重要的海產(chǎn)資源，它肉質(zhì)鮮美爽滑、營養(yǎng)豐富，有“海洋牛奶”的美稱。牡蠣中的必需氨基酸完全程度和質(zhì)量比例優(yōu)于牛乳和人乳[1]。益生菌不僅在人體腸道內(nèi)起著營養(yǎng)、激活免疫及抗感染、能減少食物過敏[2]，抗高血壓[3]，而且還具有抗過敏[4]、抗腫瘤[5]、抑制致病菌[6]，防治消化性潰瘍和改善酒精性脂肪肝等多種益生效果[7]。牡蠣多肽具有一系列生物功能，盧學(xué)敏等[8]研究發(fā)現(xiàn)牡蠣中含有一些活性肽對(duì)副溶血性弧菌、枯草芽孢桿菌等具有一定的抑制作用。Lee 等[9]酶解太平洋牡蠣并得到兩個(gè)具有HIV-1蛋白酶抑制活性的六肽。同時(shí)，牡蠣肽具有良好的抗氧化性，是一種天然的抗氧化劑，并含有重要的抗癌藥物的組分[10]；牡蠣肽還具有增強(qiáng)小鼠免疫力、游泳耐受力等良好的保健效果[11-12]。

廣西北部灣牡蠣資源豐富，但本地缺乏牡蠣深加工企業(yè)以及相關(guān)加工技術(shù)，使得北部灣處于整個(gè)牡蠣產(chǎn)業(yè)鏈的原料端，產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品的附加值低，致使產(chǎn)業(yè)技術(shù)升級(jí)艱難，因此，促進(jìn)牡蠣和牡蠣產(chǎn)品多樣化開發(fā)，提高產(chǎn)業(yè)效益迫在眉睫。本文采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化牡蠣多肽酸奶制備工藝，研制出的酸奶產(chǎn)品酸甜適中，口感較好，為牡蠣的高值化開發(fā)利用提供了可靠的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牡蠣肽粉，北部灣大學(xué)食品工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室制備保存；德氏乳桿菌德氏亞種-保加利亞菌、嗜熱鏈球菌種、副干酪乳桿菌種均為中國科學(xué)微生物研究所保藏；全脂奶粉，紐瑞滋上海食品有限公司；脫脂奶粉，恒天然商貿(mào)上海有限公司；精制白砂糖，柳州市柳冰食品廠；海藻酸鈉，思遠(yuǎn)生物科技；活性炭粉末狀食品級(jí)，海星供水網(wǎng)上店；一水檸檬酸食品級(jí)，湖北鑫潤德化工有限公司；0233 培養(yǎng)基，006 培養(yǎng)基，CGMCC 建議培養(yǎng)基；MRS 培養(yǎng)基，BR 培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；NaCl，天津市鼎盛鑫化工有限公司；NaOH，HCl，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酚酞，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；酒精，新泰市潤生醫(yī)療衛(wèi)生用品有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程圖

1.2.2 脫腥處理

采用了葉盛權(quán)[13]等人的方法，用0.5%活性炭量，調(diào)節(jié)pH 等于7.0、在恒溫水浴鍋30 ℃條件下吸附保溫0.5 h，過濾，濾液待用。

1.2.3 菌種的恢復(fù)培養(yǎng)

（1）恢復(fù)培養(yǎng)：移取4 mL 液體培養(yǎng)基至安瓿瓶?jī)?nèi)，輕震，使凍干菌粉形成懸浮液，移取2 mL 懸浮液于10 mL 的培養(yǎng)基管中，置于37 ℃培養(yǎng)下培養(yǎng)至培養(yǎng)液出現(xiàn)渾濁或有沉淀狀態(tài)，培養(yǎng)時(shí)間為20～43 h。

（2）擴(kuò)大培養(yǎng)：將恢復(fù)培養(yǎng)的菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為12～36 h。

（3）凝乳實(shí)驗(yàn)：配置濃度為10%的牛奶培養(yǎng)基，接種量為1.5%，培養(yǎng)至凝乳，牛奶凝固后，即為需要的發(fā)酵益生菌母菌種。

1.2.4 牡蠣肽酸奶制備工藝優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

以牡蠣多肽酸奶的感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察菌種（菌種保加利亞菌、嗜熱鏈球菌、副干酪乳桿菌）、菌種比例、菌種接種量、牡蠣肽添加量、白砂糖添加量、增稠劑（海藻酸鈉）添加量、發(fā)酵時(shí)間、奶粉添加量對(duì)產(chǎn)品感官品質(zhì)的影響。

1.2.4.2 響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化酸奶配方

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取影響較大的4 個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)。即選用牡蠣肽添加量、菌種接種量、白砂糖添加量、發(fā)酵時(shí)間作為影響因素，以感官評(píng)價(jià)為指標(biāo)，利用design-expert8.0.6trial 軟件，利用Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化方案。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平如表1 所示，感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2 所示。

表2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5 理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)測(cè)定

根據(jù)GB/T4789.35-2016測(cè)定乳酸菌[14]。

根據(jù)GB 4789.2-2016測(cè)定菌落總數(shù)[15]。

根據(jù)NaOH 滴定法測(cè)定酸度。

根據(jù)過量水方法測(cè)定持水力。

pH 計(jì)測(cè)量 pH 值。

1.2.6 牡蠣肽酸奶抗氧化活性測(cè)定

1.2.6.1 樣液制備

參考文獻(xiàn)[16-17]并根據(jù)實(shí)際對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行修改，稱取發(fā)酵8 h 后的酸奶5.0 g，以40%甲醇為提取液，超聲1 h 后過45 μm 有機(jī)膜，即可提取出酸奶中的抗氧化活性物質(zhì)，備用。

1.2.6.2 還原力測(cè)定

采用鐵氰化鉀法檢測(cè)還原力，取按1.2.6.1 所制備的提取物1.0 mL，先后向其中加入pH 6.6 2.5 mL 的磷酸鹽緩沖液，2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混勻，置于50 ℃水浴20 min，加入2.5 mL10% TCA 以及0.5 mL0.1%氯化鐵，混勻靜置10 min，于700 nm 測(cè)吸光值，以超純水為空白，吸光值越高，表明抗氧化效果越好。

1.2.6.3 DPPH 清除率測(cè)定

取按1.2.6.1 所制備的提取物5.0 mL，向其中加入5.0 mL 0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液，避光室溫反應(yīng)30 min，于 517 nm 處測(cè)其吸光值為 As，Ao 為 5.0 mL 蒸餾水與5.0 mL 0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液混合物于517 nm 處所測(cè)吸光值，Ac 為按1.2.6.1 所制備的提取物5.0 mL 與5.0 mL 乙醇混合后于517 nm 處所測(cè)吸光值，計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)牡蠣肽酸奶感官評(píng)分的影響

選擇菌種種類、菌種配比、菌種接種量、牡蠣肽添加量、白砂糖添加量及發(fā)酵時(shí)間作為單因素，考察其對(duì)牡蠣肽酸奶感官評(píng)分的影響，結(jié)果如圖1 所示。結(jié)合3 種菌種對(duì)牡蠣多肽酸奶感官評(píng)分，考慮酸奶的較適宜的pH 范圍（4.0～5.0）[18]，選擇嗜熱鏈球菌、保加利亞菌進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵（圖1a）。嗜熱鏈球菌：保加利亞菌種比例為3∶1 時(shí)，感官評(píng)分最高，此時(shí)產(chǎn)品pH 為4.50，牡蠣肽酸奶酸甜可口，組織狀態(tài)較好（圖1b）。菌種接種量為3.0% 時(shí)，感官評(píng)分最高，為82.6 分，此時(shí)，牡蠣肽酸奶的pH 穩(wěn)定，酸甜可口，口感細(xì)膩，無異味（圖1c）。當(dāng)牡蠣肽添加量為0.3 g/100 mL 時(shí)，感官評(píng)分最高，pH 為4.67，具有牡蠣產(chǎn)品特有的香味，風(fēng)味物質(zhì)形成良好，酸甜適中，口感細(xì)膩，無異味（圖1d）。白砂糖添加量為7.0% 時(shí)，感官評(píng)分最高，pH 為4.71，產(chǎn)品無酸澀甜膩感（圖1e）。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為7.0 h 時(shí)，感官評(píng)分最高，pH 為4.45，酸奶組織狀態(tài)好，口感酸甜可口。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間為7.0 h（圖1f）。綜上，選擇嗜熱鏈球菌、保加利亞菌進(jìn)行聯(lián)合發(fā)酵，各因素的最適量分別為菌種配比3∶1、菌種接種量3.0%、牡蠣肽添加量0.3 g/100 mL、白砂糖添加量7.0%、發(fā)酵時(shí)間7 h。

圖1 單因素對(duì)牡蠣肽酸奶感官評(píng)分的影響

2.2. 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)評(píng)分結(jié)果

以牡蠣肽添加量、菌種接種量、白砂糖添加量、發(fā)酵時(shí)間作為影響因素，以感官評(píng)分為指標(biāo)，利用design-expert8.0.6 trial 軟件設(shè)計(jì)的響應(yīng)面優(yōu)化進(jìn)行試驗(yàn)，得出感官評(píng)分如表3所示。

采用design-expert8.0.6trial 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析后，可得以下方程模型：

Y=83.64-0.47A+0.29B-0.21C+1.44D+(2.5×10-3)AB-1.46AC+(2.5×10-3)AD+0.000BC+0.047BD-(2.5×10-3)CD-1.60A2-0.34B2-1.22C2-0.37D2

由表4 可以看出，依據(jù)P值的大小可以知道顯著性的差異，P值越小顯著性越高，模型P＜0.0001 表明該模型極其顯著。失擬項(xiàng)P=0.54045＞F=0.05，表示方程模擬的失擬項(xiàng)不顯著，方程擬合程度較高，實(shí)驗(yàn)可信。P值＜F值時(shí)，該項(xiàng)具有顯著的影響，其中AB，AD，BC，BD，CD 項(xiàng)P＞0.05，說明這四項(xiàng)為不顯著項(xiàng)，表明了A 與B，A 與D，B 與C，B 與D，C 與D 之間的交互作用不明顯，AC 項(xiàng)P＜0.05，表明AC 之間具有顯著交互作用，依據(jù)P值可以知道，各因素對(duì)感官評(píng)分的影響順序?yàn)槭牵篊＞B＞A＞D。

2.2.2 響應(yīng)曲面分析

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)感官評(píng)分結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6 軟件分析得出等高線圖以及響應(yīng)曲面圖，同一個(gè)區(qū)域表示響應(yīng)值一致，等高線形成橢圓越密集，以及響應(yīng)曲面圖彎曲度越高，皆可表明因素間交互作用越顯著。圖2-圖7 是各因素間交互作用的等高線圖和響應(yīng)曲面圖。

由圖2 等高線形成橢圓的密集程度以及響應(yīng)曲面圖的彎曲程度可知，菌種接種量與發(fā)酵時(shí)間交互影響不顯著。菌種接種量在2.5%～3.0%，發(fā)酵時(shí)間在6.5～7.0 h時(shí)，感官評(píng)分最高。

圖2 菌種接種量和發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)牡蠣肽酸奶感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面圖

表4 方差分析

圖3 菌種接種量和白砂糖添加量的交互作用對(duì)牡蠣肽酸奶感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面圖

由圖3 等高線圖形成橢圓的密集程度以及響應(yīng)曲面圖的陡峭程度可知，菌種接種量與白砂糖添加量交互影響顯著。菌種接種量為2.5%～3.0%，白砂糖添加量為6.5%～7%時(shí)，感官評(píng)分最高。

圖4 菌種接種量和牡蠣肽添加量的交互作用對(duì)牡蠣肽酸奶感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面圖

由圖4 等高線圖形成橢圓的密集程度以及響應(yīng)曲面圖的陡峭程度可知，菌種接種量與牡蠣肽添加量交互影響不顯著。菌種接種量為2.5%～3.0%，牡蠣肽添加量為0.3%～0.35% 時(shí)，感官評(píng)分最高。

圖5 發(fā)酵時(shí)間和白砂糖添加量的交互作用對(duì)牡蠣肽酸奶感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面圖

由圖5 等高線圖形成橢圓的密集程度以及響應(yīng)曲面圖的陡峭程度可知，發(fā)酵時(shí)間與白砂糖添加量交互影響不顯著。發(fā)酵時(shí)間為7%～7.5%，白砂糖添加量為7%～7.5% 時(shí)，感官評(píng)分最高。

圖6 發(fā)酵時(shí)間和牡蠣肽添加量的交互作用對(duì)牡蠣肽酸奶感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面圖

由圖6 等高線圖形成橢圓的密集程度以及響應(yīng)曲面圖的陡峭程度可知，發(fā)酵時(shí)間與牡蠣肽添加量交互影響不顯著。發(fā)酵時(shí)間為6.5%～7%，牡蠣肽添加量為0.25%～3%時(shí)，感官評(píng)分最高。

圖7 白砂糖添加量和牡蠣肽添加量的交互作用對(duì)牡蠣肽酸奶感官評(píng)分影響的響應(yīng)曲面圖

由圖7 等高線圖形成橢圓的密集程度以及響應(yīng)曲面圖的陡峭程度可知，白砂糖添加量與牡蠣肽添加量交互影響不顯著。白砂糖添加量為7%～7.5%，牡蠣肽添加量為0.25%～0.3%時(shí)，感官評(píng)分最高。

響應(yīng)曲面圖呈上凸形態(tài)，表明回歸模型存在最大值，利用Design-Expert8.0.6 軟件在牡蠣酸奶基礎(chǔ)配方上進(jìn)行優(yōu)化，可得菌種接種量、發(fā)酵時(shí)間、白砂糖添加量、牡蠣肽添加量四個(gè)考察因素的最佳值分別為3.47%、8 h、7.69%、0.37 g/100mL，感官評(píng)分預(yù)期值為81.432，同時(shí)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際感官評(píng)分為83.9，高于預(yù)測(cè)值，由此說明配方優(yōu)化是可靠有效的。

2.3理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

表5 牡蠣多肽酸奶理化指標(biāo)及微生物指標(biāo)

由表5 可知，試驗(yàn)結(jié)果符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，pH 值4.02在特定范圍內(nèi)，持水力70%。

2.4 牡蠣多肽酸奶抗氧化能力研究

總還原力的檢測(cè)原理[19]主要是依據(jù)Fe3+-Fe2+之間的相互轉(zhuǎn)化，從而證明樣品是否具有抗氧化性。DPPH 清除自由基作用機(jī)理主要是通過加入抗氧化劑前后吸光值的變化計(jì)算出自由基清除率[20]。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳酸菌中會(huì)產(chǎn)生某種具有清除自由基能力的微生物[21-22]，牡蠣多肽中也含有能清除自由基的活性物質(zhì)，故而兩者的復(fù)合使用，將會(huì)產(chǎn)生增效作用，使得產(chǎn)品的抗氧化活性增強(qiáng)。本研究通過測(cè)定總還原力和DPPH 自由基清除率探討牡蠣多肽酸奶的抗氧化能力，結(jié)果如圖8 和圖9 所示。隨著樣品濃度的逐漸增加，牡蠣多肽酸奶吸光值逐漸上升，當(dāng)濃度為50 mg/mL 時(shí)可達(dá)0.257；酸奶對(duì)照則在樣品濃度為45 mg/mL 達(dá)到最高值 0.186，當(dāng)濃度為 50 mg/mL 時(shí)，吸光值開始下降；將牡蠣酸奶與酸奶對(duì)照的DPPH 自由基清除率相比較，牡蠣酸奶的清除率高于酸奶對(duì)照，牡蠣酸奶的清除率可高達(dá)25.90%，酸奶對(duì)照為18.93%，從而可知牡蠣酸奶具有一定的抗氧化活性,在一定程度上提高了牡蠣肽酸奶的附加值。

圖8 總還原力

圖9 DPPH清除率

3 結(jié) 論

以感官評(píng)分為考核指標(biāo)，采用單因素和響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)優(yōu)化牡蠣酸奶工藝，并對(duì)產(chǎn)品理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)及抗氧化指標(biāo)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，牡蠣酸奶最優(yōu)配方為菌種添加量3.47%，發(fā)酵時(shí)間8 h，糖添加量7.69%，牡蠣添加量0.37 g/100 mL，在此工藝下感官評(píng)分最高，

為83.90 分；制成牡蠣酸奶的乳酸菌總數(shù)為1.7×107cfu/mL，pH 值為4.02，滴定酸度為113 °T，持水力為70%，符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求；牡蠣肽酸奶總還原力為0.257，DPPH 自由基清除率為25.90%，抗氧化能力顯著高于對(duì)照組，說明牡蠣肽酸奶有效提高了酸奶的抗氧化能力。該工藝下的產(chǎn)品呈乳白色，色澤均勻，有光澤，香味協(xié)調(diào)，有發(fā)酵乳固有香味，組織細(xì)膩均勻無氣泡，有酸牛奶固有滋味，酸甜可口。此牡蠣酸奶配方能較好滿足感官和生產(chǎn)所需，同時(shí)為牡蠣的深加工利用提供更好的參考依據(jù)。