馮雪,王冠蕾,侯俊材

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱150030；2. 承德石油高等?？茖W(xué)校, 河北承德067000）

0 引 言

作為全球關(guān)注的食品安全問題，食源性致病菌在過去幾十年對(duì)公眾健康造成了重大威脅。而且世界衛(wèi)生組織的調(diào)查表明，食源性致病菌的毒力感染呈上升趨勢(shì)[1]?；畹牟豢膳囵B(yǎng)（viable but non-culture, VBNC）狀態(tài)是細(xì)菌對(duì)抗惡劣環(huán)境的獨(dú)特生存策略。VBNC 狀態(tài)的細(xì)菌不能在異養(yǎng)板上生長，但仍具有代謝活性、致病性和毒性。VBNC 狀態(tài)的細(xì)菌在適宜的條件下能夠恢復(fù)和恢復(fù)培養(yǎng)和致病性。VBNC 狀態(tài)下食源性病原體的出現(xiàn)促進(jìn)了食源性感染的發(fā)生[2]，且使檢測(cè)變得更加困難。因此，本文概述了VBNC 的特點(diǎn)和基于LAMP 的方法檢測(cè)VBNC，以期為檢測(cè)VBNC 的方法更新提供理論參考。

1 VBNC 細(xì)菌概述

1982 年，徐懷恕等人[3]對(duì)霍亂弧菌和大腸桿菌進(jìn)行觀察研究時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)并且提出關(guān)于細(xì)菌的“有活力但不可培養(yǎng)（Viable but non-culturable, VBNC）”狀態(tài)。細(xì)菌在處在不適宜的環(huán)境條件下，其細(xì)胞就會(huì)在形態(tài)和生理上發(fā)生變化，不再進(jìn)行分裂，導(dǎo)致在常規(guī)培養(yǎng)基上不能形成菌落，但是細(xì)胞仍然保持完整的結(jié)構(gòu)和代謝活性。許多專家認(rèn)為VBNC 狀態(tài)是某些不產(chǎn)生芽胞的革蘭氏陽性(G+)細(xì)菌和多種革蘭氏陰性(G-)細(xì)菌的抗逆反應(yīng)，這種狀態(tài)能夠幫助細(xì)菌度過逆境；也有一些專家認(rèn)為VBNC 狀態(tài)只是細(xì)菌生命循環(huán)的一個(gè)過程。

乳及乳制品含有豐富營養(yǎng)物質(zhì)，能夠滿足人體對(duì)多種營養(yǎng)元素的需要，因此它也是大部分食源性致病菌的天然培養(yǎng)基[4]。部分乳制品在巴氏殺菌過程中能夠殺死絕大部分食源性致病菌，同時(shí)乳制品的酸性條件也可以有效地抑制致病菌的生長和增殖[5]。但是，目前越來越多的研究成果表明，乳及乳制品中的致病菌能夠被誘導(dǎo)，然后進(jìn)入VBNC，它們保留毒力，在適當(dāng)?shù)臈l件下會(huì)復(fù)蘇，仍具有活力。2002 年，Gunasekera等人[6]的研究結(jié)果表明，經(jīng)過巴氏殺菌的鮮乳中明顯含有細(xì)胞亞群進(jìn)入VNBC，熱處理過程中大量的細(xì)胞不能夠形成菌落，但仍然可以轉(zhuǎn)錄翻譯，具有可以測(cè)量的代謝活性，并具有致病性。1996 年，Gahan 等人[7]對(duì)單增李斯特菌在酸奶、普通奶酪、低脂奶酪以及全脂奶酪中的耐酸性研究發(fā)現(xiàn)，70 d 后，低脂奶酪和全脂奶酪中的單增李斯特菌突變體ATM56 恢復(fù)活性，研究結(jié)果表明單增李斯特菌在乳及乳制品中存在VBNC 狀態(tài)，但是其誘導(dǎo)和復(fù)蘇因素需要進(jìn)一步研究。VBNC 狀態(tài)下的細(xì)胞復(fù)蘇能力、代謝活性、平板培養(yǎng)能力和細(xì)胞完整性區(qū)別其它幾種常見的細(xì)胞狀態(tài)，具體區(qū)別如表1所示[1]。

表1 不同狀態(tài)細(xì)胞的不同生物學(xué)特性的比較

迄今為止，已有85 種以上的細(xì)菌被誘導(dǎo)進(jìn)入VBNC 狀態(tài)，包括大腸桿菌、李斯特菌、沙門氏菌、痢疾志賀氏菌、創(chuàng)傷弧菌和乳酸桿菌[8]。Diane 和Nystrom[9]的研究表明VBNC 狀態(tài)是非芽孢細(xì)菌對(duì)抗不利環(huán)境（暴露于極端溫度、紫外線光休克、重金屬、低pH、缺乏營養(yǎng)和氧化應(yīng)激）的適應(yīng)性策略。細(xì)胞在VBNC 狀態(tài)下維持代謝活性。進(jìn)入VBNC 狀態(tài)后，細(xì)胞在保持其代謝活性的同時(shí)不受損傷，其誘導(dǎo)機(jī)制與孢子形成相似。目前，食源性細(xì)菌通常由實(shí)驗(yàn)室采用標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法進(jìn)行監(jiān)測(cè)和鑒定，包括預(yù)富集和選擇性富集，然后進(jìn)行一系列形態(tài)學(xué)和生化鑒定，通常4～7 d才能獲得鑒定結(jié)果[10]。VBNC 狀態(tài)下的細(xì)菌不能在常規(guī)平板培養(yǎng)基上定植，傳統(tǒng)的食源性致病菌檢測(cè)方法復(fù)雜、耗時(shí)長，已不適用于VBNC 狀態(tài)下的細(xì)胞檢測(cè)，在食品質(zhì)量和食源性致病菌的監(jiān)測(cè)中，迫切需要有效的方法[11]。

2 VBNC 細(xì)菌形成機(jī)制

近年來，人們對(duì)VBNC 狀態(tài)的形成機(jī)理逐漸了解。2011 年，Moorhead 等[12]人發(fā)現(xiàn)空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)對(duì)群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS)信號(hào)分子 C4-HSL、OH-C4-HSL、HSL 和 C12-HSL等有反應(yīng)，具體表現(xiàn)為延緩進(jìn)入VBNC 狀態(tài)以及阻礙生物膜的形成，此菌株自身同樣分泌一種新的化合物，其結(jié)構(gòu)功能與QS 信號(hào)分子相似，所以QS、VBNC狀態(tài)及生物膜的形成的調(diào)節(jié)機(jī)制可能相似。2014 年，這一推測(cè)被Ayrapetyan 等[13]人進(jìn)一步證實(shí)，他們發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷弧菌(V.vulnificus)在VBNC 狀態(tài)下可直接被其QS信號(hào)分子AI-2 喚醒，并證明不產(chǎn)生AI-2 的突變菌株不能從VBNC 狀態(tài)復(fù)蘇，添加外源AI-2 后可以復(fù)蘇，但是此復(fù)蘇過程不僅與信號(hào)分子AI-2 相關(guān)，可能還與σ 因子Rpo S 相關(guān)，缺失Rpo S 的突變株不能復(fù)蘇，并且加入外源AI-2 后仍然不能復(fù)蘇。這一結(jié)果與2013年Kusumoto等[14]人的研究相一致，發(fā)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌(S.enterica）的LT2 VBNC 突變體具有較高的Rpo S 表達(dá)能力，具體表現(xiàn)為延緩進(jìn)入VBNC 狀態(tài)，從而推測(cè)Rpo S對(duì)VBNC 狀態(tài)具有調(diào)控作用。

另一方面，無機(jī)聚磷酸鹽的代謝對(duì)細(xì)胞的功能具有重要的調(diào)節(jié)作用[15]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)無機(jī)磷酸鹽代謝的聚磷酸鹽激酶能夠促使細(xì)菌進(jìn)入VBNC 狀態(tài)[16-17]。并且有明確的證據(jù)指出，無機(jī)磷酸鹽及其同源酶同時(shí)存在于許多細(xì)菌體內(nèi)，說明了在細(xì)菌體內(nèi)，無機(jī)磷酸鹽的代謝可能普遍存在。而這些細(xì)菌中的大部分都具有進(jìn)入VBNC 狀態(tài)的能力[18]，這就大大增加了無機(jī)磷酸鹽代謝參與VBNC 狀態(tài)調(diào)節(jié)的可能性。但是目前為止，有關(guān)無機(jī)磷酸鹽對(duì)細(xì)菌進(jìn)入VBNC 狀態(tài)調(diào)節(jié)用的機(jī)理，觸發(fā)和復(fù)蘇等問題仍不清楚，需進(jìn)一步研究。

3 LAMP法概述

2000 年，Notomi等人[19]首次報(bào)道了一種新的檢測(cè)方法—環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）。LAMP 采用了具有長鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶和4-6 條引物，以高特異性識(shí)別目標(biāo)序列的6 個(gè)不同區(qū)域，并具有獨(dú)特的擴(kuò)增機(jī)制，其產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上能夠呈現(xiàn)出典型的階梯狀條帶；同時(shí)，反應(yīng)體系中的Mg2+與從dNTPs中析出的P2O74-結(jié)合，生成副產(chǎn)物白色Mg2P2O7沉淀；另外，因?yàn)閿U(kuò)增產(chǎn)物的大量生成，加入熒光染料后，紫外燈下能夠觀察到明顯熒光。所以，LAMP 擴(kuò)增不但觀察結(jié)果方式多樣，且結(jié)果鑒定操作簡便，對(duì)于高通量的快速檢測(cè)極為適合。因?yàn)長AMP技術(shù)具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)[20]，已經(jīng)逐漸被應(yīng)用于中沙門氏菌、阪崎腸桿菌、分支桿菌屬、金黃色葡萄球菌等病原微生物的檢測(cè)[21-24]。然而，LAMP法仍然存在一些缺點(diǎn)，例如，PCR或LAMP本身無法區(qū)分存活的死細(xì)胞和VBNC細(xì)胞的存在，導(dǎo)致對(duì)目標(biāo)微生物的高估。為了克服這個(gè)缺點(diǎn)，PCR 和LAMP 結(jié)合活性染料直接檢測(cè)活的食源性病原體[25]。近年來，人們利用DNA 插層劑來阻止死亡細(xì)菌的DNA 擴(kuò)增，乙錠單疊氮化合物（ethidium monoazide bromide，EMA）或 疊氮 溴 化 丙 錠（propidium monoazide，PMA）染料能穿透膜損傷細(xì)胞并與DNA分子結(jié)合，從而抑制死細(xì)胞的DNA 擴(kuò)增，同時(shí)允許活細(xì)胞的未結(jié)合DNA 擴(kuò)增，因此，將這些染料與PCR 或LAMP結(jié)合，來區(qū)分VBNC細(xì)胞與死細(xì)胞[26-27]。

4 LAMP的原理

LAMP 技術(shù)主要應(yīng)用的原理為鏈的置換[28]，如圖1所示，恒溫條件下通過Bst 2.0 DNA 聚合酶催化反應(yīng)的進(jìn)行。LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)分為兩步進(jìn)行，即啞鈴狀模板形成的起始步驟和反應(yīng)擴(kuò)增的循環(huán)步驟。反應(yīng)過程包含內(nèi)外部兩種引物，內(nèi)部引物由FIP（Forward Inner Priner）和 BIP（Backgroud Inner Priner）組成，其中FIP 包括 F1c 和 F2，BIP 包括 B1c 和 B2，外部引物由 F3和B3組成。

啞鈴狀模板形成的起始步驟中，經(jīng)過LAMP 循環(huán)后，每條鏈的末端會(huì)形成發(fā)夾狀的DNA 即為起始結(jié)構(gòu)。FIP上的F2與其互補(bǔ)序列F2c結(jié)合形成雙鏈，通過Bst2.0 DNA 聚合酶的催化作用，DNA 擴(kuò)增自 F2 的 5’末端開始，形成一條新的DNA單鏈與其模板鏈結(jié)合后形成新的DNA 雙鏈。以外部引物F3為起始的新鏈與其模板鏈結(jié)合形成雙鏈，原合成的DNA單鏈被置換下來，在5’末端的F1和F1c兩個(gè)區(qū)域內(nèi)進(jìn)行堿基配對(duì)，從而產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)。BIP上的B2與互補(bǔ)序列B2c相結(jié)合從而形成新鏈，然后與其模板互補(bǔ)配對(duì)形成新的DNA雙鏈，與此同時(shí)，5’端的環(huán)狀結(jié)構(gòu)打開，外部引物上的B3與B3c雜交，并以其為起點(diǎn)開始合成新鏈，以BIP起始的單鏈解離下來形成新的單鏈，其兩個(gè)末端分別為FIP 和BIP。由于兩個(gè)末端發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)，所以兩個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這就是LAMP的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。

在反應(yīng)的擴(kuò)增循環(huán)步驟中，發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的F1 末端作為起點(diǎn)，模板是其自身，進(jìn)行DNA 的擴(kuò)增延伸。同時(shí)，F(xiàn)IP 中的F2 與F2c 雜交，新一輪的置換反應(yīng)開始。F1 末端的合成單鏈脫離模板解離為單鏈。而解離后的單鏈核酸存在互補(bǔ)結(jié)構(gòu)從而導(dǎo)致環(huán)狀結(jié)構(gòu)的形成。環(huán)狀結(jié)構(gòu)上形成的B2c，與BIP 的引物雜交，開始新一輪擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP 的反應(yīng)產(chǎn)物為類似花狀的環(huán)結(jié)構(gòu)和雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

圖1 LAMP技術(shù)反應(yīng)原理

5 PMA/EMA-LAMP 在 VBNC 狀態(tài)細(xì)菌檢測(cè)中的應(yīng)用

PMA 和EMA 作為一種 DNA 分子核酸染料，只能滲透死亡細(xì)菌的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，并與其中的DNA 共價(jià)結(jié)合，阻礙其擴(kuò)增反應(yīng)的發(fā)生。PMA/EMA-LAMP 利用優(yōu)化的引物，探索了VBNC 狀態(tài)下3 種食源性致病菌不同組分的水平和比例[29]。PMA/EMA-LAMP的詳細(xì)設(shè)計(jì)如下。

首先，用一定濃度的PMA 或EMA 原液處理0.1 mL 達(dá)到107CFU 的細(xì)胞懸液，然后立即移入暗室（室溫下）靜置5 min，然后將其置于碎冰中，在15 cm的距離處暴露于鹵素?zé)簦?00 W）15 min。根據(jù)常用的基因組DNA 提取試劑盒的指示，對(duì)VBNC 和死亡細(xì)胞進(jìn)行總DNA 提取，然后進(jìn)行前面描述的LAMP 反應(yīng)。最后，通過變色、濁度、瓊脂糖凝膠分析和實(shí)時(shí)熒光分析，驗(yàn)證了該方法的可行性。

5.1 大腸桿菌

大腸桿菌(Escherichia coli)作為環(huán)境中最常見的革蘭氏陰性菌之一，引起人類嚴(yán)重的胃腸道疾病，如出血性腹瀉、出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒癥綜合征，兒童和老年人死亡率高達(dá)50%以上[30]。此外，大腸桿菌中VBNC 態(tài)的誘導(dǎo)條件（紫外線或低溫）也給消除過程帶來了障礙。VBNC 狀態(tài)下的細(xì)胞在培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)陰性結(jié)果，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2014 年，Wang 等人[31]用 PMA 或 EMA 進(jìn)行 VBNC狀態(tài)細(xì)胞與死亡細(xì)胞的分化。以大腸桿菌中特定的 rfbE 基因?yàn)榘悬c(diǎn)，采用PMA-qPCR 法對(duì)VBNC 狀態(tài)下的細(xì)胞進(jìn)行定量分析。該方法的定量限為102mL-1，但PMA-PCR 檢測(cè)時(shí)間長、檢測(cè)限低、成本高等缺點(diǎn)給其進(jìn)一步應(yīng)用帶來了很大的障礙。有研究學(xué)者采用了rBE 基因，以及主要毒素基因（STX1 和STX2）基因，并分別從快速檢測(cè)VBNC 狀態(tài)中開發(fā)出三個(gè)PMA-LAMP 檢測(cè)。研究表明，PMA 濃度為40 mg/mL 時(shí)，LAMP 檢測(cè)完全被抑制，且比色LAMP 檢出限為 10 pg/mL，比 PCR（10 ng/mL）更敏感，特異性和陽性預(yù)測(cè)值均為100%。

5.2 副溶血性弧菌

副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)作為一種廣泛分布于沿海和河口環(huán)境中的嗜鹽菌，在所有流行的食物中毒暴發(fā)中，特別是在生的或未煮熟的海鮮中，有50%～70%被分離為致病因子[32]。副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性桿菌，在低溫下易被誘導(dǎo)進(jìn)入VBNC 狀態(tài)。目前，副溶血性弧菌的常規(guī)檢測(cè)方法需要7 d 的時(shí)間。因此，迫切需要快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法[33]。

大量研究表明[34-35]，耐熱直接溶血素（tdh）基因作為副溶血性弧菌的特異性標(biāo)記物，可以使用PMA-PCR 篩查VBNC 狀態(tài)。然而，很少有研究報(bào)道EMA 或PMA 聯(lián)合LAMP 檢測(cè)副溶血性弧菌。2012年，Wang[36]開發(fā)了一種EMA-LAMP分析法，用于區(qū)分副溶血性弧菌的VBNC狀態(tài)細(xì)胞和死亡細(xì)胞。值得注意的是，EMA 對(duì)VBNC 狀態(tài)下的副溶血性弧菌DNA擴(kuò)增沒有抑制作用，這與PMA不同。LAMP法和PCR法對(duì)模板的敏感性分別為9 fg/管和900 pg/管，說明LAMP 法比 PCR 法更敏感。此外，Zhong[37]等人在2016年開發(fā)了一種基于PMA的實(shí)時(shí)熒光燈分析法，用于檢測(cè)VBNC狀態(tài)下的副溶血性弧菌，該方法利用了副溶血性弧菌中的熱標(biāo)記溶血素(tlh)基因。26株中有10株為不同血清型的副溶血性弧菌，非副溶血性弧菌有16株。結(jié)果表明，PMA-RF-LAMP在4mg/mL的PMA作用下，再暴露5 min，可用于區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。另一方面，在不受食物基質(zhì)、死細(xì)胞和其他細(xì)菌干擾的情況下，對(duì)26株參考菌株的特異性為100%。

5.3 葡萄球菌

金黃色葡萄球菌(S.aureus）是一組革蘭氏陽性、兼性需氧菌，通常是未被包裹的有機(jī)體，可導(dǎo)致多種組織感染和多種疾病[38]（包括皮膚感染、肺炎、心內(nèi)膜炎和骨髓炎）。葡萄球菌腸毒素可引起的葡萄球菌食物中毒，是一種重要的食源性致病菌，是世界上最重要的食源性疾病之一，占食物中毒暴發(fā)病例的95%，是世界范圍內(nèi)公共衛(wèi)生的主要問題。傳統(tǒng)的金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基檢測(cè)方法通常需要6 d，可能存在假陰性[39]。同時(shí)，在VBNC 狀態(tài)下，用上述培養(yǎng)基方法檢測(cè)不到金黃色葡萄球菌。在金黃色葡萄球菌的監(jiān)測(cè)中，建立一種快速、靈敏、經(jīng)濟(jì)、操作簡便的檢測(cè)方法，對(duì)處于VBNC 狀態(tài)的金黃色葡萄球菌進(jìn)行鑒定，并采取相應(yīng)的預(yù)防措施[40]。

目前，已有學(xué)者證明可以將LAMP 應(yīng)用于以nuc基因?yàn)榘悬c(diǎn)的金黃色葡萄球菌分離株的鑒定。然而，nuc 基因作為檢測(cè)金黃色葡萄球菌的合適靶點(diǎn)的適用性可能需要進(jìn)一步深入的研究，因?yàn)樗拿舾行缘陀赑CR。2012 年，Xu[41]等人。首次對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌和非葡萄球菌進(jìn)行了3 種LAMP 鑒別試驗(yàn)的開發(fā)和應(yīng)用。此外，PMA-LAMP 法在VBNC 狀態(tài)下檢測(cè)金黃色葡萄球菌方面也取得了顯著進(jìn)展。該方法具有快速、簡單（對(duì)于過程和結(jié)果測(cè)定）、成本效益低（等溫設(shè)備、水浴或熱塊）、靈敏度高、廣泛性和應(yīng)用靈活性高的顯著優(yōu)點(diǎn)。在不含環(huán)引物的情況下，該方法在65 ℃下檢測(cè)時(shí)間為65 min，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基檢測(cè)和PCR 檢測(cè)相比，縮短了檢測(cè)時(shí)間。

5.4 單增李斯特菌

單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一種重要的食源性致病菌，也是乳制品、蔬菜和畜禽產(chǎn)品等食品的主要污染菌[42]，世界衛(wèi)生組織已將其列為四大食源性致病菌之一[43]，所以，研究者密切關(guān)注單增李斯特菌的污染問題。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法需要分離、篩選以及生化鑒定等步驟，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此，建立快速準(zhǔn)確的檢測(cè)方法具有十分重要的意義。

由于LAMP 技術(shù)特異性高、靈敏性強(qiáng)、簡便快速的特點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于檢測(cè)致病菌的研究中[44]，但是LAMP 技術(shù)是以DNA 為檢測(cè)對(duì)象，所以此方法不能區(qū)分活/死細(xì)胞，易出現(xiàn)結(jié)果呈假陽性的現(xiàn)象。2011年，蔣亞男等人[45]建立了PMA-LAMP 的分析方法快速檢測(cè)單增李斯特活菌，同時(shí)，比較分析了PMA-PCR 方法的靈敏度。2012 年，呂淑霞等人[46]采用EMA-LAMP 方法，同樣可以快速的檢測(cè)單增李斯特菌。利用PMA/EMA-LAMP 技術(shù)，不僅能夠有效識(shí)別單增李斯特菌的活/死細(xì)胞，而且具有較高的靈敏度。同時(shí)，PMA/EMA 與LAMP 相結(jié)合的技術(shù)與PCR 技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)等[47-48]相比，避免使用類似PCR 等昂貴的設(shè)備，減少了DNA 熱變性、溫度循環(huán)等步驟，所以其檢測(cè)成本更低、反應(yīng)更迅速、操作更簡便。

6 展 望

食源性致病菌的VBNC 狀態(tài)是各種食源性致病菌存在的獨(dú)特機(jī)制，給公眾健康帶來了嚴(yán)重威脅。采用可靠的檢測(cè)方法對(duì)VBNC 細(xì)胞進(jìn)行簡單、靈敏的鑒定是非常重要的。由于VBNC 細(xì)胞的活性和不可培養(yǎng)性，給傳統(tǒng)的CFU 檢測(cè)帶來了障礙，基于LAMP 的檢測(cè)方法已逐漸成為鑒定VBNC 狀態(tài)細(xì)胞的可靠工具。雖然表現(xiàn)相同，但PMA 比EMA 更有效地抑制活、死信號(hào)。綜上所述，PMA/EMA-LAMP 或其他基于LAMP 的方法在人們面臨多種傳染病威脅的地區(qū)研究局部流行病具有很大的潛力。此外，建立了PMA-RF-LAMP 法定量分析細(xì)菌的VBNC 狀態(tài)，拓寬了其應(yīng)用范圍。然而，在擴(kuò)增反應(yīng)中還存在一些缺陷和缺陷，如污染和假陽性現(xiàn)象。在今后的工作中，各種技術(shù)（PMA/EMA-LAMP 和表面等離子體共振生物傳感器）的合作可以開發(fā)出簡單有效的遺傳檢測(cè)裝置，能更有效的檢測(cè)VBNC 細(xì)胞。