郭艷榮，黨娜，蘇馨，劉文俊，孫天松

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

0 引 言

埃塞俄比亞位于非洲東北部，是中東、非洲及亞洲的“十字路口”，以咖啡貿(mào)易著稱，有傳統(tǒng)手工咖啡制作和傳統(tǒng)發(fā)酵面食等食品加工技藝。同時(shí)，埃塞俄比亞也是非洲最大的蜂蜜生產(chǎn)國，其蜂蠟生產(chǎn)排名世界第四，有多達(dá)幾百萬蜂蜜集群和800 多種蜂蜜資源作物[1]。

蜂蜜酒是酒的一種，蜂蜜中加水稀釋，經(jīng)過發(fā)酵生成酒精而制成[2]。蜂蜜中含有極高的糖分，極高的滲透壓使微生物難以繁殖，將蜂蜜以水稀釋后，糖分的濃度下降，微生物能夠在適宜的滲透壓下繁殖，開始發(fā)酵。蜂蜜酒被認(rèn)為是人類釀造的第一種酒精飲料，約有1 萬年的歷史[3]。Mead 是埃塞俄比亞出產(chǎn)的著名蜂蜜酒。它是用當(dāng)?shù)氐姆涿壑瞥傻?，用煙、樹葉和 Gesho（Rhamnus Prinoides）的樹枝調(diào)味，給人一種酒花般的味道[4]。

面引子是傳統(tǒng)面食加工中的發(fā)酵劑，其中含有多種微生物，包括各類酵母菌及少量細(xì)菌，能引發(fā)多個(gè)生化反應(yīng)，混合協(xié)同發(fā)酵產(chǎn)生復(fù)雜的風(fēng)味物質(zhì)，賦予面食更加細(xì)致的質(zhì)地、細(xì)膩的口感和更為豐富的風(fēng)味[5]。Teff是埃塞俄比亞地區(qū)由不同谷物制成的發(fā)酵食品，包括高粱，玉米，小麥，大麥等一些谷物的組合[6]。大多數(shù)埃塞俄比亞人對(duì)Teff 的喜愛程度超過了其他任何食品。它是一種稀薄的軟發(fā)酵烘焙食品，通常使用來自不同來源的天然發(fā)酵劑[7]，根據(jù)環(huán)境溫度進(jìn)行24～96 h的發(fā)酵后獲得[8-9]。

埃塞俄比亞也是咖啡生長的天然產(chǎn)地，獨(dú)特的地理環(huán)境和氣候條件，使得這里的咖啡富有一種葡萄酒的香味，由此釀造的咖啡果酒也深受人們喜愛[10]。

這些傳統(tǒng)發(fā)酵食品和飲品，使用傳統(tǒng)技術(shù)經(jīng)多種原材料制成，獨(dú)特的加工方式，加之飲食結(jié)構(gòu)和地理位置等的差異，導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)品中乳酸菌的多樣性，越來越受到研究人員的關(guān)注。而目前，咖啡，蜂蜜酒和面引子中關(guān)于酵母菌的報(bào)道較為常見[11-13]，而對(duì)其中的乳酸菌卻鮮有報(bào)道。本文采用實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)方法對(duì)埃塞俄比亞地區(qū)采集的4 份發(fā)酵食品中的乳酸菌進(jìn)行分離純化，運(yùn)用16S rRNA 基因序列分析方法對(duì)分離株進(jìn)行鑒定，對(duì)埃塞俄比亞地區(qū)發(fā)酵食品中乳酸菌的多樣性進(jìn)一步分析，以便了解該地區(qū)食品中乳酸菌的組成與種類，為豐富傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌資源提供菌種。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

本實(shí)驗(yàn)所研究的樣品是由中國科學(xué)院微生物所研究員惠贈(zèng)，研究人員于2019 年5 月，在埃塞俄比亞季馬，Sekoru 等地區(qū)采集，包括咖啡、蜂蜜酒、面引子等共計(jì)4 份樣品。將采集的樣品立即放置在低溫保存，及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行乳酸菌的分離純化等研究。

表1 埃塞俄比亞地區(qū)采集樣品信息

1.2 培養(yǎng)基與試劑

培養(yǎng)基：MRS 固體培養(yǎng)基和MRS 液體培養(yǎng)基，M17 固體培養(yǎng)基和 M17 液體培養(yǎng)基。MRS、M17 培養(yǎng)基均購自英國Oxoid 公司。

試劑：脫脂乳保護(hù)劑，提取DNA 所用試劑，PCR擴(kuò)增和電泳檢測所用試劑。細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，天根生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

pH 計(jì)（FE20），梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；全自動(dòng)高壓干熱滅菌器（ADVANTEC SP-650），日本ALP 公司；恒溫培養(yǎng)箱（LRH-500F），上海一恒科技有限公司；光學(xué)顯微鏡（BX50），日本OLYMPUS公司；電熱恒溫水浴鍋（HWS28），上海一恒科技公司；梯度基因擴(kuò)增儀（MJRESEARCH PTC-200），伯樂公司；電泳儀（DYY-12），北京六一生物科技有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng)（UVPGDS-8000），UVP 公司；微量紫外分光光度計(jì)（ND-1000），Nanodrop公司。

1.4 乳酸菌的計(jì)數(shù)

乳酸菌計(jì)數(shù)根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]采用MRS 和M17 培養(yǎng)基法菌落計(jì)數(shù)法，將樣品用PBS 緩沖液進(jìn)行梯度稀釋，然后用傾注法進(jìn)行計(jì)數(shù)，37 ℃培養(yǎng)48 h 進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，所有樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

1.5 乳酸菌的分離純化及保存

蜂蜜酒，咖啡等液體樣品中乳酸菌計(jì)數(shù)方法參考劉紅新等人對(duì)哈薩克斯坦傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌多樣性的研究，采用涂布培養(yǎng)法[14]。

面引子樣品需要先在脫脂乳培養(yǎng)基中進(jìn)行增菌培養(yǎng)12 h，然后取發(fā)酵凝乳的培養(yǎng)基0.5 mL 進(jìn)行10 倍梯度稀釋，傾注培養(yǎng)。厭氧培養(yǎng)48 h 后，菌落形成進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算樣品活菌數(shù)。

采用涂布法對(duì)樣品進(jìn)行稀釋涂布，37 ℃培養(yǎng)48后，獲得樣品中的不同菌落，觀察并記錄菌落形態(tài)（顏色、形狀、大小、邊緣等），挑取特征菌落，于對(duì)應(yīng)的固體培養(yǎng)基上劃線2～3 次，直至獲得純培養(yǎng)物。經(jīng)革蘭氏染色，過氧化氫酶觸試驗(yàn)，將疑似乳酸菌的純培養(yǎng)物進(jìn)行保藏，以待后續(xù)試驗(yàn)。

1.6 總DNA 的提取及純度的檢測

將乳酸菌二代純培養(yǎng)液（2 mL），8 000 r/min 離心1 min，棄上清液，收集離心到的菌體。采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取乳酸菌DNA，并用ND-1000型微量紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA 濃度和純度進(jìn)行檢測并記錄。

1.7 16S rRNA 基因的 PCR 擴(kuò)增

將濃度偏大的DNA 稀釋到100 ng/μL 左右，配制PCR 反應(yīng)體系，利用梯度基因擴(kuò)增儀進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增和測序。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，以提取菌株的基因組DNA 的稀釋液為模板，引物為27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1495R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）[15]。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）及擴(kuò)增程序如表2所示。

表2 PCR反應(yīng)體系（50 μL）及擴(kuò)增程序

擴(kuò)增完畢后，將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，若在1 500 bp 處有清晰明亮的擴(kuò)增條帶，且無拖尾、彌散現(xiàn)象，則PCR 擴(kuò)增成功[16]。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海美吉生物公司進(jìn)行純化和DNA 測序。

1.8 同源性分析

將測序得到的 DNA 序列運(yùn)用 SeqMan（DNAStar5.01）軟件進(jìn)行序列拼接后，通過Blast 程序（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）與 Gen Bank數(shù)據(jù)庫中的已知細(xì)菌的核酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，以同源性大于99%為種的分界閾值，將待鑒定菌株與對(duì)應(yīng)模式菌種的16S rRNA 基因序列用MEGA 6.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的計(jì)數(shù)結(jié)果

表3 埃塞俄比亞地區(qū)采集樣品乳酸菌活菌計(jì)數(shù)結(jié)果

由表3 可知，本次采集樣品中兩份面引子樣品的活菌數(shù)相對(duì)較高，而蜂蜜酒和咖啡樣品中含乳酸菌較少。

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 乳酸菌分離株的菌落形態(tài)及表型特征

根據(jù)乳酸菌的形態(tài)學(xué)特征[17-18]，初步從4 份樣品中共分離出55 株疑似乳酸菌的菌株。在MRS 和M17 固體培養(yǎng)基上菌株的菌落呈圓形，中等大小，凸起，乳白色，濕潤，邊緣整齊，有些菌落表面光滑，有些粗糙。經(jīng)過革蘭氏染色、過氧化氫酶反應(yīng)，均為革蘭氏陽性，過氧化氫陰性菌。初步將55 株菌定為乳酸菌。

2.2.2 菌種DNA 提取和16S rRNA 擴(kuò)增結(jié)果

DNA 濃度和 OD260/280的測定：OD260/280值在 1.8～2.0 間即為純DNA 樣品。將其質(zhì)量濃度稀釋至100 ng/μL 后對(duì)乳酸菌分離株16S rRNA 基因進(jìn)行擴(kuò)增。經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以觀察到在大約1 500 bp 的位置處有一條清晰明亮的條帶，并且無彌散現(xiàn)象，無明顯非特異擴(kuò)增現(xiàn)象。

圖1 部分菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建和乳酸菌鑒定結(jié)果

將測序獲得的16S rRNA 基因序列通過NCBI 數(shù)據(jù)庫中BLAST 進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，以與模式菌株序列同源性大于99%為種的鑒定閾值，將55 株分離株鑒定為乳酸菌的3個(gè)屬，11個(gè)種。

圖2 部分菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

由圖2可以看出，IMAU97880與模式菌株Lactobacillus crustorum（AM285450）聚為一類，且同源性為100%，故將其鑒定為Lactobacillus crustorum。菌株IMAU97863與 模 式 菌 株Lactobacillus plantarumATCC14917（AJ965482）聚為一類，且同源性為100%，因此可將其鑒定為Lactobacillus plantarum。菌株IMAU97879 與模式菌株Lactobacillus zymae（AJ632154）聚為一類，且同源性為 100%，故將其歸為Lactobacillus zymae。菌株IMAU97858 與模式菌株Streptococcus thermophilusATCC 19258 聚為一類，且同源性為100%，因此可將其歸為Streptococcus thermophilus。菌株IMAU97894 與模式菌株Enterococcus faeciumATCC19434（AJ301830）聚為一類，同源性為100%，將其鑒定為Enterococcus faecium。菌株IMAU97893與模式菌株Lactobacillus harbinensis（AB196123）聚為一類，且同源性高達(dá)100%，因此可將其歸為Lactobacillus harbinensis。菌株菌株IMAU97889與模式菌株Lactobacillus paracaseiATCC25302（D79212）聚為一類，且同源性達(dá)到100%，因此鑒定為Lactobacillus paracasei。菌株IMAU97862與模式菌株Lactobacillus helveticus（AM113779）聚為一類，同源性達(dá)到100%，故將其歸為Lactobacillus helveticus。IMAU97905 與模式菌株Lactobacillus reuteriATCC23272（L23507）聚為一類，且同源性高達(dá)100%，故將其鑒定為Lactobacillus reuteri。菌株IMAU97852與模式菌株Lactobacillus pontisATCC51518（X76329）聚為一類，同源性為98%，故將其歸為Lactobacillus pontis。IMAU97868 與模式菌株Lactobacillus panis（X94230）聚為一類，且同源性為100%，故將其鑒定為Lactobacillus panis。

2.3 優(yōu)勢菌種分析

乳酸菌的分布結(jié)果如表4所示。

埃塞俄比亞地區(qū)發(fā)酵食品中乳酸菌的分離結(jié)果見表4。由表4 可知，4 份發(fā)酵食品中分離出的55 株乳酸菌疑似株，經(jīng)16S rDNA 序列測定和同源性分析鑒定，分屬于3 個(gè)屬11 個(gè)種或亞種，Lactobacillus pontis為埃塞俄比亞地區(qū)發(fā)酵食品中的優(yōu)勢菌種，占總分離株的32%。其中ASE1 蜂蜜酒樣品共分離出16 株乳酸菌，Lactobacillus paracasei為優(yōu)勢菌種，占 ASE1 樣品總分離數(shù)的75%。ASE2 咖啡果酒樣品僅分離出2 株乳酸菌，均為Lactobacillus reuteri。ASE3、ASE4 兩份面引子樣品共分離出37 株乳酸菌，均含有Lactobacillus pontis和Lactobacillus helveticus，但優(yōu)勢菌種不同，ASE3 樣品的優(yōu)勢菌種為Lactobacillus pontis，占ASE3 樣品總分離數(shù)的78%，而ASE4 樣品的優(yōu)勢菌種為Lactobacillus zymae，占ASE4樣品總分離數(shù)的55%。

表4 埃塞俄比亞地區(qū)發(fā)酵食品中乳酸菌的分離結(jié)果

如表5 所示，為不同研究人員對(duì)3 種發(fā)酵食品中乳酸菌的分離鑒定結(jié)果對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)蜂蜜酒中所含的微生物不同，Bulgasem 等人對(duì)馬來西亞等地區(qū)中蜂蜜的分離鑒定表明蜂蜜中重要含有乳桿菌屬和片球菌屬乳酸菌[19]，Snowdon 等人的研究則在蜂蜜中發(fā)現(xiàn)了芽孢桿菌，腸球菌和產(chǎn)黃菌屬（Flavobacterium）乳酸菌[20]，而我們從埃塞俄比亞地區(qū)蜂蜜酒中分離到了乳桿菌屬及腸球菌屬乳酸菌?？Х戎腥樗峋鄬?duì)較少，Bruyne 等人從咖啡中分離到1 株Leuconostoc holzapfeliisp. nov[21]，本研究中也僅分離到2 株羅伊氏乳桿菌。我們也對(duì)比了同為埃塞俄比亞地區(qū)的面引子中乳酸菌的分離情況，發(fā)現(xiàn)GASHE 等人分離的TEF 面引子樣品中優(yōu)勢菌株為乳桿菌屬[22]，Tilahun等人的分離鑒定結(jié)果則表明腸球菌屬是優(yōu)勢菌株[23]，而我們對(duì)2 份面引子的研究結(jié)果也表明乳桿菌屬是優(yōu)勢菌株。

表5 不同地區(qū)3種傳統(tǒng)發(fā)酵食品中乳酸菌的菌群結(jié)果比較

3 結(jié) 論

從埃塞俄比亞地區(qū)采集的4份傳統(tǒng)發(fā)酵食品樣品中乳酸菌活菌數(shù)為 1.7×101～1.25×104CFU/mL，乳酸菌含量均較低。4份乳樣品中共分出55株菌，經(jīng)鑒定分別歸屬 于Lactobacillus pontis、Lactobacillus paracasei、Lactobacillus zymae、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus panis、Enterococcus faecium、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus harbinensis、Streptococcus thermophilus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus crustorum11 個(gè)種或亞種。其中Lactobacillus paracasei為埃塞俄比亞地區(qū)蜂蜜酒中的優(yōu)勢菌株，占該樣品總分離株的75%，Lactobacillus pontis為該地區(qū)面引子中的優(yōu)勢菌種，占該樣品總分離株的41%。