謝芳，李孟偉，唐振華，彭開屏，彭麗娟，梁辛，楊承劍

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，南寧530001）

0 引 言

我國水牛資源豐富，主要集中在廣西、云南、貴州、四川等地，水牛具有較強(qiáng)的抗病和免疫力，迄今尚未有水牛瘋牛病例報(bào)道[1]。水牛奶作為我國南方地區(qū)的一種特色優(yōu)勢乳品，幾乎含有人體所需營養(yǎng)元素及微量元素，在民間享有“奶中之王”的美譽(yù)[2],水牛奶乳化特性好，膽固醇低，酪蛋白含量高，深加工優(yōu)勢明顯。而作為生產(chǎn)乳品的基礎(chǔ)，原料乳的品質(zhì)備受關(guān)注，其微生物含量又是衡量乳品質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)，故了解原料乳中微生物多樣性至關(guān)重要。

近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，高通量測序技術(shù)作為“下一代”測序技術(shù)已迅速發(fā)展，研究者們已將高通量測序技術(shù)應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，包括海洋、土壤、植物和腸道環(huán)境，而利用高通量測序?qū)θ槠愤M(jìn)行研究的報(bào)道較少, 人們對(duì)原料乳中微生物的組成也沒有很好的描述，然有關(guān)水牛乳微生物多樣性的研究也尚未見報(bào)道[3]，研究人員更多的是采用純培養(yǎng)方法，根據(jù)菌落的生長形態(tài)和生理生化實(shí)驗(yàn)來確定其微生物的種類和數(shù)量。謝芳[4]等采用傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法，從三品雜交水牛乳中分離出一百多株乳酸菌，并對(duì)其進(jìn)行了測序鑒定。由此對(duì)水牛乳中可培養(yǎng)乳酸菌的多樣性有了初步了解，但僅通過這種傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)去認(rèn)識(shí)水牛乳中微生物的多樣性是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。

因此，本研究將采用16S rDNA 高通量測序技術(shù)，分別對(duì)廣西水牛研究所種畜場存欄的純種印度摩拉水牛、巴基斯坦尼里/拉菲水牛以及三品雜水牛的原料乳進(jìn)行分析，擬借助生物學(xué)方法對(duì)原料乳的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以期更全面解析水牛原料乳中細(xì)菌的多樣性，比較不同品種水牛乳中微生物群落結(jié)構(gòu)及其組成差異，旨為后續(xù)乳品加工、乳品安全以及菌種發(fā)掘等提供詳實(shí)的微生物學(xué)背景資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

原料乳樣本采集自廣西水牛研究所水牛種畜場，分別采自純種印度摩拉水牛、純種巴基斯坦尼里-拉菲水牛及水牛所培育的三品雜水牛三個(gè)水牛品種，每個(gè)品種采集三頭水牛原料乳等體積混合樣本，分別編號(hào)為 N1(三品雜)、N2(摩拉)、N3(尼里·拉菲)，采樣時(shí)間為剛擠完奶10 min 左右，經(jīng)無菌離心管密封好后于置于4 ℃冰上迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-20 ℃冰箱冷藏備用。

1.2 樣本總DNA 提取和PCR 擴(kuò)增

取50 mL 水牛乳樣品，以12 000 r/min 高速冷凍離心30 min，用滅菌脫脂棉去掉乳脂層，棄上清液，收集底部沉淀[5]，按E.Z.N.A.?soil 試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross, GA, U.S.)說明書進(jìn)行總DNA 抽提，DNA 濃度和純度利用NanoDrop2000 進(jìn)行檢測，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量；為避免序列太長影響測序，同時(shí)兼顧擴(kuò)增特異性，選用338F(5-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3)和806R(5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3)引物對(duì)V3-V4 可變區(qū)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃ 預(yù)變性 3 min，27 個(gè)循環(huán)（95 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸 30 s），最后 72 ℃ 延伸 10 min（PCR 儀：ABI GeneAmp?9700 型）。擴(kuò)增體系為 20 uL，4 uL 5*FastPfu 緩沖液，2 uL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 uL引物（5 umol/L），0.4 uLFastPfu 聚合酶；10ng DNA 模板。

1.3 Illumina Miseq 測序

使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (AxygenBiosciences, Union City, CA, USA) 進(jìn)行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor?-ST (Promega, USA)進(jìn)行檢測定量。根據(jù)Illumina MiSeq 平臺(tái)(Illumina,SanDiego,USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE 2*300 文庫。文庫構(gòu)建步驟：(1)連接“Y”字形接頭。(2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段。(3)利用PCR 擴(kuò)增進(jìn)行文庫模板的富。(4)氫氧化鈉變性,產(chǎn)生單鏈DNA 片段。利用Illumina 公司的Miseq PE300 平臺(tái)進(jìn)行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。原始數(shù)據(jù)上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Trimmomatic 軟件處理原始測序數(shù)據(jù)，使用FLASH 軟件進(jìn)行拼接：(1)設(shè)置50 bp 的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口前端位置截去該堿基后端所有序列，之后再去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列。(2)根據(jù)重疊堿基overlap 將兩端序列進(jìn)行拼接，拼接時(shí)overlap 之間的最大錯(cuò)配率為0.2，長度需大于10 bp。(3)根據(jù)序列首尾兩端的barcode 和引物將序列拆分至每個(gè)樣本，barcode 需精確匹配，引物允許2 個(gè)堿基的錯(cuò)配，去除存在模糊堿基的序列。使用的UPARSE 軟件（version 7.1 http://drive5.com/uparse/)根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU 聚類，并在聚類過程中去除單序列和嵌合體。利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/) 對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)Silva 數(shù)據(jù)庫（SSU123），設(shè)置比對(duì)閾值為70%。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)與聚類分析

通過對(duì)3 份水牛乳樣本進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA 高通量測序，共得到優(yōu)化序列 139356 條，平均長度426.404 bp，具體測序數(shù)據(jù)見表1、圖1和圖2。

表1 樣本測序數(shù)據(jù)分析

圖1 Sobs稀釋性曲線

對(duì)序列數(shù)據(jù)量進(jìn)行隨機(jī)抽取，統(tǒng)計(jì)抽取樣本的序列數(shù)和OUT 數(shù)[6]，繪制樣本稀釋性曲線(Rarefaction curve)，如圖1 顯示，3 樣本的曲線都逐漸趨于平緩，說明增加測序量可能會(huì)發(fā)現(xiàn)新的OUT，但圖2 中3 樣本Shannon 曲線明顯趨于平坦，表明樣本大部分微生物已產(chǎn)生，更大的測序量不會(huì)引起物種多樣性的顯著增長[7]，故本研究現(xiàn)有數(shù)據(jù)量的分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。Shannon 指數(shù)曲線（圖2）也同時(shí)表明，樣本N3 的微生物群落比N1和N2更具多樣化。

圖2 Shannon 曲線

選取屬水平的OTU 列表，（三品種的水牛乳是在屬水平下，對(duì)其OUT 進(jìn)行分類）在相似性為97%的水平下對(duì)聚類結(jié)果進(jìn)行分析，繪制OTU 韋恩圖。從圖3 中可以看出，3 品種水牛乳樣本共得到OTU 為540，其中 N1(三品雜)、N2(摩拉)、N3(尼里·拉菲)各自包含的 OTU 數(shù)目分別為 297、88 和 469，三品種所共有的OTU 數(shù)目為 66，N1、N2、N3 所特有的 OTU 數(shù)目分別為54、14 和224，其余OTU 為三樣本間兩兩共有的物種數(shù)目，其中，N1(三品雜)與N3(尼里·拉菲)共有的OTU 較多，為174，說明這兩個(gè)品種的水牛乳樣本共有的核心微生物較多，物種組成較相似，而N3(尼里·拉菲)所特有的OTU 最多，為224，這預(yù)示著N3(尼里·拉菲)品種擁有比N1(三品雜)、N2(摩拉)更豐富的細(xì)菌微生物種類。

圖3 OTU分布韋恩圖

2.2 物種組成與豐度分析

以O(shè)TU 的物種分類結(jié)果為依據(jù)，通過菌落餅圖（圖4）在屬水平對(duì)3 樣本中的細(xì)菌種類和相對(duì)豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本文自定義相對(duì)豐度＞8%的菌群為優(yōu)勢菌群。相對(duì)豐度＜0.1%的菌不統(tǒng)計(jì)。由圖4 可知，N1(三品雜)和N3(尼里·拉菲)中的微生物種類變化不大，但各種細(xì)菌所占百分比有所變化，二者共有的細(xì)菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸球菌屬（Enterococcus）、大腸埃希菌屬-志賀菌（Escherichia-Shigella）、鏈球菌屬（Streptococcus）、放線菌屬（Actinomyces）、庫克菌屬（Kocuria）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus），其中N1(三品雜.SP)的優(yōu)勢菌為腸球菌屬 34.3%（Enterococcus）、假單胞菌屬 13.7%（Pseudomonas）、大腸埃希菌屬-志賀菌8.1%（Escherichia-Shigella），N2(摩拉.ML)中主要以籍伏氏菌屬88.3%(Vogesella)為主，占比88.3%其次是黃桿菌屬（Flavobacterium）4.95%和硫氧化湖沉積桿菌（Limnobacter）2.84%，N3(尼里·拉菲)中主要以假單胞菌屬52.8%（Pseudomonas）為優(yōu)勢菌，另有4.93%的棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、4.86%不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）及18.8%未分類的其它細(xì)菌。

圖4 a（N1）、b(N2)、c(N3)為樣本基于屬水平的群落組成

圖5 樣本基于屬水平的群落豐度分布

圖5 通過柱形圖從屬水平描述N1(三品雜)、N2(摩拉)、N3(尼里·拉菲)三樣本中微生物菌群結(jié)構(gòu)的組成，不同顏色的柱子代表不同的物種，柱子的長短代表該物種所占比例大小，由圖5 可知，三品雜、摩拉、尼里·拉菲三個(gè)水牛乳樣本中主要微生物菌群分布差異明顯，N1(三品雜) 、N2(摩拉) 、N3(尼里·拉菲)的優(yōu)勢菌群分別為腸球菌屬（Enterococcus）、籍伏氏菌屬（Vogesella）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。三樣本共鑒定出有21 個(gè)共有的細(xì)菌屬，它們分別是籍伏氏菌屬（Vogesella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸球菌屬（Enterococcus）、大腸埃希菌屬-志賀菌（Escherichia-Shigella）、鏈球菌屬（Streptococcus）、放線菌屬（Actinomyces）、庫克菌屬（Kocuria）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、乳酸桿菌（Lactobacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、黃桿菌屬（flavobacterium）、糞便假棍狀桿菌屬（pseudoclavibacter）、土壤芽胞桿菌屬（Solibacillus）、硫氧化湖沉積桿菌（Limnobacter）、水棲菌屬（Enhydrobacter）、羅斯氏菌屬（Rothia）、肉桿菌屬（Ignavigranum）、氣球菌屬（Aerococcus）、嗜冷桿菌（Psychrobacter）、雷爾氏菌屬（Ralstonia），其中N3(尼里·拉菲)的細(xì)菌種類最多，覆蓋15個(gè)屬，這預(yù)示著尼里·拉菲品種的水牛乳中微生物多樣性最豐富，三樣本細(xì)菌豐度大小依次為N3(尼里·拉菲)＞N1(三品雜)＞N2(摩拉)。

2.3 樣本間菌群比較分析

為研究不同樣本物種組成結(jié)構(gòu)的相似性和差異關(guān)系，可對(duì)樣本距離矩陣進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建樣本層級(jí)聚類樹。樣本聚類樹可以直觀地反映樣本間菌群的相似度[8]。3 個(gè)不同品種水牛乳樣本基于屬水平OTU 的聚類樹見圖6，樹枝長度代表樣本間的距離，分支寬度表示樣本間距離的遠(yuǎn)近，相似度越高，距離越小[9]。由圖6 可知，3 原料乳樣本聚類成兩個(gè)群，N1(三品雜)與N3(尼里·拉菲)聚成一類，相似度較高，N2(摩拉)與 N1(三品雜)和 N3(尼里·拉菲)的相似度差別較大。很顯然，不同品種的水牛乳菌群組成結(jié)構(gòu)不同，差異明顯。

圖6 樣本層級(jí)聚類分析

基于OUT 的分類結(jié)果，在種分類水平對(duì)N1(三品雜)、N2(摩拉)、N3(尼里·拉菲)3 樣本進(jìn)行比較分析，其共有或獨(dú)有的細(xì)菌數(shù)量見表2，合并小于1%的數(shù)值區(qū)域，發(fā)現(xiàn)在其共有的65 個(gè)種層面的菌群中，占比大于1%的細(xì)菌有8 個(gè)，其分布情況見圖7，不同顏色表示不同的物種，餅面積表示該物種數(shù)目占物種總數(shù)目的百分比。由圖7 可知，3 樣本共有的核心菌落較多，并以假單胞菌屬（Pseudomonas）和腸球菌屬（Enterococcus）為主。N1(三品雜)與N3(尼里·拉菲)共有的菌落種類為210，占總數(shù)的48.8%，這說明N1(三品雜)與N3(尼里·拉菲)的菌落構(gòu)成具有較高的相似性。N3(尼里·拉菲)特有的菌落最多，為163，占物種總數(shù)的37.9.%，說明N3(尼里·拉菲)特有的物種豐度最高。

樣本通過降維分析后，在主成分上均有相對(duì)坐標(biāo)點(diǎn)，樣本點(diǎn)越接近，表明兩樣本物種組成越相似。由圖8 可知，樣本 N1、N2 和 N3 均分離較開，沒有聚類現(xiàn)象，且主成分1（PC1）和主成分2(PC2)對(duì)樣本差異性的貢獻(xiàn)值分別達(dá)到了75.95%和24.05%，可以代表全部變量信息，說明這三個(gè)不同品種的水牛乳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在顯著差異。

表2 樣本（種分類水平）共有或獨(dú)有的物種數(shù)量

圖7 樣本基于種水平的物種占比

3 結(jié) 論

圖8 樣本基于屬水平的主成分分析

本研究利用高通量測序，首次對(duì)N1(三品雜) 、N2(摩拉) 、N3(尼里·拉菲)3 品種的水牛原料乳細(xì)菌多樣性進(jìn)行解析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3 樣本所含微生物共覆蓋314個(gè)屬430 個(gè)種，呈現(xiàn)出較豐富的多樣性。其中假單胞菌屬（Pseudomonas）、腸球菌屬（Enterococcus）、大腸埃希菌屬-志賀菌（Escherichia-Shigella）、鏈球菌屬(Streptococcus)放線菌屬（Actinomyces）、庫克菌屬（Kocuria）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）為3 樣本所共有且占比較大的細(xì)菌屬，N1 、N2、N3 優(yōu)勢菌群分別為腸球菌屬（Enterococcus）、籍伏氏菌屬（Vogesella）和假單胞菌（Pseudomonas）。3 樣本中均檢出了病原性大腸埃希菌屬-志賀菌（Escherichia-Shigella）。相較傳統(tǒng)鑒定，高通量測序更全面和準(zhǔn)確地反映了水牛原料乳中菌群的多樣性，為后續(xù)研究者評(píng)估水牛乳中菌群對(duì)水牛乳品質(zhì)的影響提供了技術(shù)支持。