馬進(jìn)軍 張家祥 李結(jié)華

(安徽醫(yī)科大學(xué) 1第一附屬醫(yī)院干部心血管內(nèi)科，安徽 合肥 230032；2公共衛(wèi)生學(xué)院)

動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管的重要危險(xiǎn)因素之一，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早期干預(yù)顯得尤為重要。同型半胱氨酸(Hcy)是蛋氨酸的中間代謝產(chǎn)物，在體內(nèi)主要通過甲基化途徑和轉(zhuǎn)硫途徑代謝，研究發(fā)現(xiàn)高Hcy血癥與頸動脈內(nèi)-中膜厚度(IMT)和頸動脈狹窄呈正相關(guān)，是頸動脈硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一〔1〕。頸動脈因位置表淺、檢測方便無創(chuàng)被作為動脈硬化評估的指標(biāo)。Hcy與AS的機(jī)制復(fù)雜，可能與氧化應(yīng)激、內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞炎性因子等導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞增殖有關(guān)〔2〕。單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP)-1是促炎性因子，促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞的遷移和組織浸潤，參與動脈硬化的形成和發(fā)展。本研究分析Hcy和頸AS的關(guān)系，同時(shí)通過體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，檢測MCP-1的含量，探討Hcy引起動脈硬化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1研究對象與方法 納入2016～2017年安徽省直醫(yī)院住院的226例缺血性腦卒中患者，根據(jù)頸動脈超聲檢查結(jié)果分為頸動脈內(nèi)膜正常組(91例)，內(nèi)膜增厚組(24例)，斑塊組(100例)和狹窄組(11例)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡60～90周歲；②入院后完善血生化檢查和頸動脈彩超檢查；③無頸動脈支架或內(nèi)膜剝脫術(shù)史；④病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近期使用影響Hcy的藥物如B族維生素，甲氨蝶呤等；②甲狀腺功能異常；③肝腎功能異常；④認(rèn)知障礙、不能配合檢查者。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，p38抗體、磷酸化p38抗體購自美國Santa cruz Biotechnology公司，MCP-1抗體購自美國Sigma公司。

1.2主要儀器 全自動生化分析儀，電泳儀DYY-10(Ecp3000 北京六一儀器廠)，TGL-18R冷凍離心機(jī)(珠海黑馬儀器廠)。

1.3Hcy水平測定 所有患者空腹12 h以上，晨起用生化管抽取靜脈血5 ml，迅速離心后使用全自動生化儀測量血糖、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、血尿酸(UA)、Hcy水平等指標(biāo)。

1.4頸動脈超聲 采用Philips Epiq7C彩色多普勒超聲診斷儀，被檢查者平臥，檢測頸總動脈、頸動脈分叉處、頸內(nèi)動脈，IMT，并觀察有無斑塊形成，狹窄程度及斑塊性質(zhì)。選取雙側(cè)頸總動脈遠(yuǎn)端及頸內(nèi)動脈分叉膨大部1.0～1.5 cm血管壁，分別測量動脈前后壁內(nèi)膜表面間垂直距離及管腔內(nèi)膜界面為IMT，IMT<1.0 mm為正常，1.0≤IMT≤1.5 mm為IMT增厚，IMT>1.5 mm，斑塊凸向管腔為斑塊形成，頸動脈斑塊導(dǎo)致管腔狹窄>50%為頸動脈狹窄。

1.5人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 培養(yǎng)基中加入不同濃度Hcy(0、1、10、100、1 000 μmol/L)，另將培養(yǎng)基分為對照組，Hcy組和Hcy+SB203580(p38通路特異性抑制劑)，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測定人血管內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1 mRNA水平，PCR產(chǎn)物(MCP-1 290 bp，GAPDH 454 bp)在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。MCP-1上游GCTGACCCCAAGAAGGAATG、下游TGAGGTGGTTGTGGAAAAGG、GAPDH上游CGTCCCGTAGACAAAATGGT、下游TTGATGGCAACAATCTCCAC。MCP-1和GAPDH的吸光度比值為mRNA的相對表達(dá)量。

1.6實(shí)時(shí)定量PCR檢測 提取人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞RNA，按照試劑盒操作步驟轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用SYBR Green 燃料在實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行上機(jī)檢測。

1.7Western印跡檢測 放射免疫沉淀(RIPA)緩沖液提取人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定總蛋白濃度，質(zhì)量相等的蛋白提取物經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上進(jìn)行蛋白印跡分析，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、χ2檢驗(yàn)及Logistic回歸分析。

2 結(jié) 果

2.1各組一般資料比較 各組年齡、性別、高血壓者比例、糖尿病者比例、體重指數(shù)(BMI)、TC、TG、LDL-C和血UA水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；狹窄組HDL-C水平與內(nèi)膜正常組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與內(nèi)膜正常組相比，內(nèi)膜增厚組、斑塊組及狹窄組Hcy水平明顯升高(P<0.05)，隨著IMT增加，血Hcy水平依次增加，見表1。

表1 各組一般資料分析

2.2頸動脈硬化程度影響因素 以頸動脈硬化分組為因變量，以Hcy水平為自變量，進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)Hcy水平是內(nèi)膜增厚、斑塊和狹窄的危險(xiǎn)因素(P均<0.05)，見表2。

表2 頸動脈硬化程度影響因素Logistic回歸分析

因變量賦值，頸動脈硬化程度：正常=0，內(nèi)膜增厚=1，斑塊=2，狹窄=3；自變量賦值，Hcy水平正常=0，增高=1

2.3不同濃度Hcy處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1 mRNA表達(dá) 隨著Hcy劑量增加，MCP-1基因表達(dá)水平不斷升高(0、1、10、100、1 000 μmol/L Hcy處理MCP-1 mRNA表達(dá)分別為1.00±0.06、1.09±0.44、2.01±0.23、3.19±0.27、3.88±0.30)。

2.4Hcy處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞p38蛋白表達(dá) 與對照組(1.00±0.09)比較，Hcy組磷酸化p38水平(3.30±0.34)明顯升高，Hcy+SB203580組表達(dá)水平(1.82±0.38)顯著降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞p38蛋白表達(dá)

2.5使用SB203580后Hcy處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1表達(dá) 與對照組(1.00±0.88、1.00±0.14)比較，Hcy組MCP-1 mRNA和蛋白(2.89±0.28、4.00±0.35)水平明顯升高，Hcy+SB203580組MCP-1 mRNA和蛋白水平(1.44±0.11、1.90±0.19)均顯著降低(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1蛋白表達(dá)

3 討 論

AS是多數(shù)心血管疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)，冠心病、缺血性腦血管性疾病等一旦出現(xiàn)難以逆轉(zhuǎn)的AS終末期病變，患者遠(yuǎn)期死亡率將極大增加〔3〕。因此監(jiān)測和控制亞臨床階段的AS就顯得尤為重要，頸動脈IMT(CIMT)測定是一種簡便、無創(chuàng)的利用超聲監(jiān)測頸動脈壁的技術(shù)，它常被認(rèn)為是早期AS的替代指標(biāo)，被廣泛用于臨床篩查〔4〕。Hcy是一種含巰基氨基酸，來源于飲食中必需氨基酸甲硫氨酸的中間代謝產(chǎn)物。血清Hcy水平升高為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其水平與性別、年齡、葉酸水平、腎功能等因素有相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)Hcy水平與CIMT或頸動脈狹窄程度呈正相關(guān)，結(jié)果與前期研究結(jié)果一致〔5〕。同時(shí)，Hcy水平是頸動脈硬化的主要危險(xiǎn)因素之一。

頸動脈硬化斑塊中含有大量炎性細(xì)胞浸潤，血管積聚大量的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，因此有研究提出AS病變的形成實(shí)際上是對內(nèi)膜損傷做出的一系列炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用〔6,7〕。AS作為一種慢性炎癥疾病，內(nèi)皮細(xì)胞受損后誘導(dǎo)炎性因子釋放是AS發(fā)生主要起始原因之一。前期研究〔8,9〕發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化斑塊中檢測到MCP-1等趨化因子含量的升高。MCP-1可誘導(dǎo)表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和單核細(xì)胞，不僅具有趨化單核細(xì)胞移動的功能，而且對血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，因而，在趨化吸引及調(diào)節(jié)單核細(xì)胞黏附和跨內(nèi)皮遷移的過程中具有十分重要的作用〔10〕；另外，MCP-1 是細(xì)胞內(nèi)與膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝過程密切相關(guān)的生物大分子，也參與了AS的病理過程〔11〕，本研究發(fā)現(xiàn)Hcy處理可增加人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1水平，進(jìn)一步論證了Hcy與MCP-1的關(guān)系。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞內(nèi)，將細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)〔12〕，p38MAPK是MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的主要組成部分之一，在體內(nèi)調(diào)控多種促炎因子的表達(dá)，同時(shí)在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中具有重要作用〔13〕。多數(shù)研究認(rèn)為動脈粥樣硬化是炎癥驅(qū)動的過程，因此p38 MAPK的研究備受關(guān)注，有研究發(fā)現(xiàn)研究顯示，磷酸化p38 MAPK在大鼠AS斑塊組織中過度磷酸化，并且在血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)有p38 MAPK的表達(dá)〔14〕，磷酸化p38 MAPK通路可以促進(jìn)MCP-1的大量表達(dá)，是其產(chǎn)生的關(guān)鍵上游分子〔15〕，本次實(shí)驗(yàn)使用Hcy處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，磷酸化p38的表達(dá)量明顯升高，使用SB203058，一種p38 MAPK特異性抑制劑，發(fā)現(xiàn)磷酸化p38的表達(dá)明顯降低；同時(shí)，使用SB203580后，Hcy處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞MCP-1表達(dá)水平明顯降低，表明p38 MAPK通路在Hcy介導(dǎo)MCP-1表達(dá)的作用機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，血清Hcy濃度是CIMT增厚的主要原因之一，Hcy處理后MCP-1水平在AS發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用；然而，本實(shí)驗(yàn)樣本量有限，且未能得到人群MCP-1水平，在后期研究中需要加大樣本量并對其機(jī)制進(jìn)行深入探討。