馬一聞 陳超 畢素貞 莊文欣 付文玉 呂娥

(濰坊醫(yī)學(xué)院 1生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 濰坊 261053；2醫(yī)學(xué)研究實驗中心；3組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室)

帕金森病(PD)是廣泛存在于中老年群體的神經(jīng)退行性疾病，PD的確切發(fā)病機制是醫(yī)學(xué)界的一大難題，目前已經(jīng)確定PD的病理癥狀以不能運動，休息震顫和多巴胺(DA)能神經(jīng)元的喪失為特征〔1〕。已有大量研究表明由膠質(zhì)細胞激活觸發(fā)的神經(jīng)炎癥在PD的發(fā)病機制中起著重要作用?；罨募毎a(chǎn)生促炎因子等炎癥介質(zhì)，又反向刺激于這些細胞來表達炎性因子〔2〕。Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)途徑普遍存在由干擾素和細胞因子激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在免疫應(yīng)答的起始和調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。JAK/STAT途徑的異常激活在諸如PD和多發(fā)性硬化的神經(jīng)炎癥疾病中非常明顯〔3〕。白細胞介素(IL)-6是JAK/STAT途徑中最有效的激活劑之一，PD中明顯升高，且與PD的患病風險密切相關(guān)〔4〕。

褪黑素(MT)是一內(nèi)源性神經(jīng)激素，且具有多靶點生物活性的小分子物質(zhì)〔5〕。本課題組發(fā)現(xiàn)，MT對1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)所致的PD小鼠模型上有較好的抗炎效果，而MT抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)的機制不明。結(jié)合JAK-STATs信號通路的特性和MT多靶點治療研究進展，本研究擬采用1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶脫氫物(MPP+)損傷PC12細胞的PD模型，探討 MT的抗神經(jīng)炎癥作用及利用JAK/STAT通路改善神經(jīng)炎癥的可能性，從而為MT防治神經(jīng)退行性疾病的研究提供可靠的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1細胞、試劑和儀器 小鼠嗜鉻細胞瘤(PC)12細胞(上海中國科學(xué)院細胞庫)；MT、MPP+、細胞裂解液(RIPA)(均Sigma公司)；胎牛血清和RPMI-1640(均HyClone公司)；細胞毒性/增殖檢測試劑盒CCK-8(YEASEN公司)；胰蛋白酶(Solarbio公司)；兔抗多克隆抗體磷酸化的(p)-STAT1、p-STAT3、STAT1、STAT3(均Immunoway公司)；兔抗多克隆抗體IL-17A、IL-1β和IL-6(均Bioss公司)；化學(xué)發(fā)光液(Thermo 公司)。Multiskan FC型酶標儀(Thermo Fisher公司)；Western印跡高電流電泳儀(BIO-RAD公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(愛博科技貿(mào)易公司)。

1.2細胞分組及處理 細胞培養(yǎng)基為10%胎牛血清加1%青鏈霉素混合液(青鏈霉素濃度均為100 μg/ml)，培養(yǎng)于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中。傳至4代后，胰蛋白酶消化(0.25%)處于對數(shù)期且狀態(tài)良好的細胞，并制成細胞懸液調(diào)配到適宜濃度后接種于孔板中，并分為如下四組：對照組；模型組：200 μmol/L的MPP+干預(yù)36 h(預(yù)實驗中檢測不同濃度MPP+的損傷效果，其中200 μmol/L最佳)；治療組：200 μmol/L的MPP+處理12 h后，再加入800 μmol/L的MT處理24 h(預(yù)實驗中采用不同藥物濃度進行篩選，發(fā)現(xiàn)800 μmol/L MT修復(fù)效果最佳，后續(xù)實驗采用此濃度給予干預(yù))；MT組：加入800 μmol/L的MT處理24 h(與治療組加入MT的時間相同)。

1.3顯微鏡觀察細胞形態(tài) 將各組細胞混懸液滴加到6孔板中，接種各孔劑量1 ml濃度為3×105個/ml，12 h后將細胞分組及藥物干預(yù)，每隔12 h觀察細胞并拍照。

1.4CCK-8法檢測細胞活性 將制好的細胞混懸液以4×103個/ml濃度每孔100 μl的劑量滴加到96孔板中，細胞分組并給予MPP+及MT干預(yù)，吸去原有培養(yǎng)基，加入CCK-8培養(yǎng)基混合液100 μl并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，酶標儀檢測各孔450 nm的吸光度值。

1.5免疫細胞化學(xué)法檢測IL-1β、IL-6的含量 將PC12細胞濃度為1×105個/ml的懸液以400 μl每孔的劑量滴加到24孔板中進行爬片，培養(yǎng)12 h后分組并加藥干預(yù)。吸除各孔中培養(yǎng)基，依照劉金城等〔6〕方法步驟進行細胞處理和后續(xù)細胞免疫組織化學(xué)流程，一抗為兔抗IL-1β(1∶200)、IL-6(1∶200)抗體(30 μl/孔)，結(jié)果采用Image Pro Plus5.1軟件進行平均光密度值(MOD)分析。

1.6Western印跡法檢測IL-17A、IL-6、p-STAT1、p-STAT3、STAT1和STAT3的蛋白表達 將3×105個/ml PC12細胞懸液接種至6孔板中每孔1 ml，細胞分組給予藥物，蛋白提取、濃度檢測、Western印跡的詳細步驟及顯影參照劉飛等〔7〕的實驗方法，實驗中滴加一抗，分別為兔抗多克隆抗體IL-17A(1∶1 500)、IL-6(1∶1 500)、p-STAT1(1∶800)、p-STAT3(1∶800)、STAT1(1∶1 000)、STAT3(1∶1 000)和小鼠抗GAPDH(1∶1 000)抗體。實驗結(jié)果采用Image J軟件分析各組條帶的吸光度(AA)，目的蛋白AA與GAPDH蛋白AA比值表示各目的蛋白的相對表達值。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1MT可修復(fù)MPP+對PC12細胞的損傷 對照組細胞分布均勻，胞體發(fā)出不規(guī)則突起；模型組漂浮細胞大量出現(xiàn)，細胞內(nèi)有空泡，細胞出現(xiàn)聚集，折光性升高，胞體萎縮變圓顏色發(fā)暗；而給予MT后，治療組細胞狀態(tài)有所好轉(zhuǎn)，貼壁細胞數(shù)量增多，聚集現(xiàn)象及萎縮的胞體較少，細胞折光性降低；MT組細胞分布狀態(tài)、外形結(jié)構(gòu)、生長狀態(tài)及后續(xù)各項檢測與對照組相比，均無顯著性差異。見圖1。

2.2MT可阻止MPP+導(dǎo)致的 PC12細胞活力的下降 與對照組(0.66±0.04)相比，模型組細胞活力(0.40±0.07)明顯變?nèi)酰慌c模型組比較，給予MT后治療組細胞活力明顯好轉(zhuǎn)(0.58±0.09，P<0.05)，MT組細胞活力(0.69±0.04)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3MT可降低MPP+誘導(dǎo)的PC12細胞的神經(jīng)炎癥反應(yīng) 與對照組相比，模型組IL-1β、IL-6 MOD及IL-17A、IL-6蛋白表達顯著增加(P<0.05)，與模型組比較，治療組IL-1β、IL-6 MOD及IL-17A、IL-6蛋白表達明顯減少(P<0.05)。MT組IL-1β、IL-6 MOD及IL-17A、IL-6蛋白表達與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1，圖2。對照組細胞形態(tài)良好，染色較淡；而模型組部分細胞內(nèi)存在空泡，且存在聚集現(xiàn)象，陽性細胞染色加深；與模型組比較，治療組細胞狀態(tài)較好，細胞空泡較少，染色變淡。見圖3。

2.4MT可抑制MPP+誘導(dǎo)的PC12細胞的JAK-STATs信號通路的激活 與對照組比較，模型組p-STAT1、p-STAT3表達均明顯增高(均P<0.05)，與模型組比較，治療組p-STAT1、p-STAT3明顯降低(均P<0.05)。各組STAT1、STAT3無明顯變化。MT組各指標與對照組均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見圖4、表2。

表1 各組PC12細胞IL-1β和IL-6MOD、IL-17A和IL-6蛋白表達

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

圖2 IL-17A和IL-6蛋白在各組PC12細胞的相對表達

圖3 IL-1β和IL-6在各組PC12細胞中的表達(DAB，×200)

圖4 p-STST1、STAT1、p-STAT3和STAT3蛋白在各組PC12細胞的相對表達

表2 各組PC12細胞p-STST1、STAT1、p-STAT3和STAT3蛋白表達相對值

3 討 論

全基因組關(guān)聯(lián)研究表明，強調(diào)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(包括PD)的發(fā)病機制或調(diào)節(jié)與免疫系統(tǒng)基因的關(guān)聯(lián)，認為神經(jīng)炎癥反應(yīng)和促炎介質(zhì)釋放的調(diào)節(jié)可能會影響癥狀和嚴重程度〔8〕。臨床研究發(fā)現(xiàn)伴有震顫的PD患者在腦脊液和血清中IL-6水平 顯著增強〔9〕。本實驗發(fā)現(xiàn)，在給予MPP+處理后，細胞狀態(tài)呈現(xiàn)顯著惡化，細胞活力明顯降低，促炎因子IL-17A、IL-1β和IL-6表達顯著上升。

先天性免疫反應(yīng)在神經(jīng)炎癥中具有致病和保護作用，這取決于疾病的發(fā)病機制和中樞神經(jīng)系統(tǒng)所處的微環(huán)境，小膠質(zhì)細胞、T細胞等是參與監(jiān)測該微環(huán)境的主要細胞〔10〕，而JAK/STAT途徑的激活可加重致病性神經(jīng)炎癥的進展。Zhu等〔11〕用特異性JAK抑制劑預(yù)處理可減少STAT3的磷酸化并阻斷抗炎因子IL-10介導(dǎo)的針對脂多糖(LPS)損傷的腹側(cè)中腦原代神經(jīng)元的保護作用。用聚集的α-突觸核蛋白(SYN)刺激小膠質(zhì)細胞系或原代小膠質(zhì)細胞可導(dǎo)致主要組織相容性復(fù)合因子(MHC)Ⅱ類的表達和一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和IL-1β產(chǎn)生，通過JAK1/2抑制劑AZD1480可抑制JAK/STAT途徑的激活〔12〕。Przanowski等〔13〕在LPS導(dǎo)致的模型上發(fā)現(xiàn)，p-STAT1、p-STAT3、p-STAT5可誘發(fā)產(chǎn)生促炎因子。本研究發(fā)現(xiàn)給予MPP+可誘發(fā)PC12細胞p-STAT1、p-STAT3表達上升。

MT是由松果體分泌的一種具有睡眠調(diào)節(jié)、增強免疫、抗癌活性、抗炎抗氧化特性和神經(jīng)保護等強大功能的吲哚類激素〔14〕，可通過質(zhì)膜上的特定細胞受體或其他非受體依賴性途徑發(fā)揮其作用。MT可調(diào)節(jié)自身免疫性脊髓炎小鼠模型的少突膠質(zhì)細胞的功能，減少促炎因子(IL-1β和TNF-α)和增加抗炎因子(IL-4和IL-10)來減輕炎癥，降低神經(jīng)功能障礙評分并增強髓鞘再生〔15〕。MT對6-羥基多胺(OHDA)誘導(dǎo)的偏側(cè)PD大鼠模型具有抗氧化和神經(jīng)保護作用〔16〕，可對表達PD相關(guān)表型基因parkin/PINK1/DJ-1/MUL1的斑馬魚胚胎發(fā)揮挽救作用〔17〕。本實驗發(fā)現(xiàn)，MT可有效減輕MPP+誘導(dǎo)PC12細胞所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)并抑制p-STAT1和p-STAT3表達。

綜上，MT可降低MPP+誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并通過進一步探討發(fā)現(xiàn)MT可抑制JAK-STATs信號通路中p-STAT1和p-STAT3表達來降低IL-1β、IL-6、IL-17A等促炎因子的表達，進而參與神經(jīng)保護作用，為MT在PD的臨床治療提供了可靠的實驗和理論依據(jù)。