陳維達 劉曉婷 陳澤濤

(1山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250355；2山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院；3濰坊市中醫(yī)院)

缺血性腦卒中是腦血管病最常見的一種類型，占全部腦卒中的60%～80%〔1〕，中醫(yī)方面又稱“中風”。它導致的神經功能障礙常對患者的生活質量造成嚴重影響，且發(fā)病率、致殘率、復發(fā)率極高。滌痰湯出自《濟生方》,有益氣祛痰、化濁開竅的功能，是治療急性期缺血性腦卒中的有效方劑。劉曉婷等〔2〕研究發(fā)現，加味滌痰湯灌胃對缺血再灌注(CIR)損傷大鼠神經功能有保護作用，但并未詳細探討滌痰湯對CIR損傷關于自噬方面的具體機制。已有研究表明〔3〕，自噬在CIR損傷中具有重要作用。自噬不僅參與細胞死亡，同時也是細胞在惡劣環(huán)境中維持自我內環(huán)境穩(wěn)定的一種保護機制。本文通過對大鼠進行右側大腦中動脈栓塞(MCAO)構建CIR模型，探討加味滌痰湯對CIR損傷大鼠腦細胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1材料 2016年2月至2017年2月選取SPF級雄性SD大鼠90只(北京維通利華實驗動物技術有限公司提供)，體重140～160 g。加味滌痰湯方藥組成：膽南星 12 g、石菖蒲10 g、橘紅10 g、梔子10 g、枳實10 g，半夏9 g，水蛭6 g、生大黃6 g；采用北京康仁堂藥業(yè)全成分中藥配方顆粒，每劑 9.6 g。吡拉西坦片(山東仁和堂藥業(yè)有限公司生產，批號 20160122，劑量：0.4 g/片)。Western印跡主要試劑見表1。

1.2構建CIR損傷模型 術前禁食、禁水6 h。以10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉大鼠，麻醉滿意后，參照Clark等〔4〕的方法，對大鼠進行可逆性MCAO線栓法栓塞右側大腦中動脈，縫合皮膚切口。術中以加熱板保持大鼠肛溫在37℃左右。假手術組除不插入線栓外余手術過程相同。缺血90 min后拔出栓線進行CIR，90 min 后參照Longa等〔5〕制定的標準對大鼠進行神經功能障礙評分。本實驗選用神經功能評分為1～3分進行右側MCAO成功的大鼠和0分的假手術大鼠。

表1 Western印跡主要試劑

LC3-Ⅱ:自噬相關蛋白微管相關蛋白1輕鏈Ⅱ

1.3實驗分組 實驗共分為5組：假手術組隨機納入假手術大鼠5只；模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組各隨機納入造模成功的CIR損傷的大鼠各5只。

1.4方法 于造模成功后24 h給藥，1次/d，連續(xù)給藥7 d，中藥高劑量組給予加味滌痰湯0.768 g/(kg·d)，中藥低劑量組給予加味滌痰湯0.384 g/(kg·d)，西藥組給予吡拉西坦片0.1 g/(kg·d)，假手術組與模型組給予等量的生理鹽水，灌胃容積為10 ml/kg。于給藥周期結束24 h內，每組取5只大鼠采用Western印跡測定腦組織中LC3-Ⅱ、Beclin1、Bcl-2的表達。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析、LSD-t法。

2 結 果

2.1用藥后各組腦組織LC3-Ⅱ、Beclin 1、Bcl-2的表達 與假手術組比較，模型組缺血腦組織中LC3-Ⅱ、Beclin 1、Bcl-2表達顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，中藥高劑量組、低劑量組及西藥組LC3-Ⅱ、Bcl-2表達均顯著降低(P<0.05)。中藥高劑量組及西藥組Beclin1表達顯著下降(P<0.05)，見圖1、表2。

1～5：假手術組、模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組圖1 用藥后各組腦組織LC3-Ⅱ的表達

表2 各組Bcl-2、Beclin1、LC3-Ⅱ表達比較

與假手術組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3 討 論

滌痰湯是腦卒中急性期治療的傳統(tǒng)方劑，具有滌痰開竅之功效。近年來，在缺血CIR動物模型與體外細胞培養(yǎng)等方面的研究進一步明確了滌痰湯藥理作用的機制。張勇等〔6〕將CIR損傷大鼠MCAO隨機分組，結果顯示術后72 h滌痰湯組較模型組神經功能缺損程度顯著改善，腦組織受損程度明顯減輕。劉玲等〔7〕用同樣的方法進行研究，發(fā)現術后72 h滌痰湯組缺血側腦組織細胞凋亡率明顯降低，表明滌痰湯的神經保護作用可能與抑制缺血后細胞凋亡有關。本研究采用的加味滌痰湯是在滌痰湯基礎上化裁而來，治療腦卒中急性期痰瘀互結、化熱動風者。

自噬是真核細胞利用溶酶體對衰老、過剩的生物大分子(如蛋白質)及受損的細胞器進行分解代謝的過程〔8〕。既往研究證明〔9〕，缺血缺氧是自噬激活的重要誘因之一。自噬過程由一系列自噬相關蛋白(Atg蛋白)介導完成，LC3是自噬體膜上的標記蛋白。LC3-Ⅱ被用來作為自噬體的標記，其水平在某種程度上反映了自噬體的數量〔10〕。本研究結果表明，在缺血CIR發(fā)生發(fā)展的病理過程中自噬機制參與其中，且自噬是被激活的，這與既往研究結果相同〔9〕。另外，LC3-Ⅱ表達的降低反映出自噬受到抑制。因此，CIR發(fā)生后自噬加劇缺血后的腦損傷；加味滌痰湯能減輕CIR后的腦損傷，其機制與抑制CIR損傷后發(fā)生的自噬有關。

Beclin1基因是哺乳動物參與自噬的特異性基因，是形成自噬體的必需分子，在一定程度上可代表自噬的活性，能夠調節(jié)自噬體膜合成和物質轉運。Bcl-2家族是一組結構域的高度同源蛋白系列，在細胞凋亡中起重要調節(jié)作用。Bcl-2作為經典的抗凋亡蛋白，在調控細胞自噬的過程中也有重要作用。此外，Bcl-2還能通過多種機制調控氧化應激，而氧化應激在誘導自噬和凋亡中均發(fā)揮作用〔11,12〕。當細胞內環(huán)境穩(wěn)定時，Beclin1與Bcl-2家族蛋白持續(xù)結合，并抑制自噬的發(fā)生。Bcl-2蛋白能阻止Beclin1蛋白與調控因子Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(PI3KC3)特異性結合，或減少PI3KC3磷酸化活性而起到抑制自噬的作用。當細胞發(fā)生饑餓或應用自噬誘導劑使自噬增強時，繼而發(fā)生Beclin1與Bcl-2的解聚〔13〕，使Beclin1依賴的自噬增加，提示Bcl-2對自噬起抑制作用。由此可見，自噬與凋亡之間存在復雜的調控關系，而Beclin1與Bcl-2的平衡狀態(tài)則是調控自噬與凋亡互反饋作用的關鍵因素。

本研究結果說明，在缺血缺氧條件下，機體通過上調Beclin1的表達來誘導自噬的激活；同時，Bcl-2表達的升高表明抗凋亡作用的增強。目前普遍認為自噬和凋亡在特定情況下可以相互轉化，共同促進細胞死亡。自噬抑制凋亡的主要機制是線粒體自噬，線粒體受損時細胞內的自噬激活因子會被激活，使細胞啟動自噬來挽救細胞，自噬就會對受損的線粒體進行捕捉并將其降解消除，以防止細胞發(fā)生凋亡〔14〕。本研究表明，中藥高劑量組能有效抑制自噬；且高劑量組優(yōu)于低劑量組，表明存在量效關系，高劑量能更有效抑制自噬的發(fā)生。

綜上，加味滌痰湯能通過干預腦缺血CIR損傷后的自噬，調節(jié)自噬活性，抑制LC3-Ⅱ、Beclin1的表達，有效下調自噬，起到缺血CIR后神經保護的作用。但自噬發(fā)生的機制及調節(jié)通路十分復雜，本文僅就加味滌痰湯對自噬的影響做了研究，至于其發(fā)揮神經保護的分子機制、確切的調節(jié)通路及如何調控自噬與凋亡的發(fā)生等問題，有待進一步研究。