梁高灃,張 濤,李 永,孫小婷,李宗軍,蔡傳江,姚軍虎,曹陽春

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

殼聚糖是由幾丁質(zhì)脫乙酰后獲得的功能性多糖，一般用粘度來表示不同的分子量和聚合度。殼聚糖因具有很強(qiáng)的抗菌作用而在醫(yī)藥等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[1-2]。殼聚糖對革蘭氏陽性菌較為敏感，會(huì)抑制瘤胃中革蘭氏陽性菌的數(shù)量，從而減少乙酸的生成[3-4]。反芻動(dòng)物所需能量中，60%～70%是以揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的形式供給[5]。相比乙酸和丁酸，丙酸作為唯一生糖型VFA，可提高能量效率、促進(jìn)瘤胃發(fā)育、緩解酮病[6]。先前的體外[7-8]及體內(nèi)[9-10]試驗(yàn)均表明，殼聚糖可調(diào)控瘤胃發(fā)酵促進(jìn)丙酸產(chǎn)生。有體內(nèi)試驗(yàn)表明，殼聚糖可提高奶牛的飼料效率[11]、丙酸濃度、氮利用效率和產(chǎn)奶量[10]，還可通過轉(zhuǎn)移VFA改變瘤胃發(fā)酵模式，影響乙酸和丁酸的產(chǎn)生，降低甲烷產(chǎn)量，進(jìn)而減少奶牛采食過程中的能量損失[8,12]。體外試驗(yàn)也證明了殼寡糖可增加丙酸濃度，降低乙丙比，進(jìn)而提高能量利用效率及飼料轉(zhuǎn)化率[13]。有研究表明，不同聚合度殼聚糖對同一種細(xì)菌有不同的敏感性，從而對瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生不同結(jié)果[9-10,14]。因此，本試驗(yàn)旨在通過體外法探究不同聚合度的殼聚糖對奶山羊體外瘤胃發(fā)酵的影響，為殼聚糖應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，用帶有8個(gè)800 mL發(fā)酵罐的人工瘤胃發(fā)酵系統(tǒng)(Sanshin, Tokyo, Japan)，共分為對照組、低聚合度(<200 mPa·s)、中聚合度(200～400 mPa·s)、高聚合度(>400 mPa·s)殼聚糖(Aladdin，中國上海)4個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)處理隨機(jī)分配于發(fā)酵罐中。每個(gè)處理殼聚糖添加量為20 mg/g。共2期試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)周期為11 d，其中預(yù)試期為8 d，采樣期為3 d。

1.2 奶山羊飼養(yǎng)及管理

從5頭健康、無病、體重相似(55±1 kg)且安裝永久性瘤胃瘺管的成年西農(nóng)薩能奶山羊中收集瘤胃液。5只瘤胃瘺管奶山羊在采集瘤胃液之前未接觸殼聚糖添加劑，飼養(yǎng)于西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧試驗(yàn)基地，每只進(jìn)行隔離單籠飼養(yǎng)。每天飼喂兩次(8:00和17:00)，日糧精粗比為30:70，全天自由飲水。

1.3 人工唾液制備

(A液)：CaCl2·2H2O 13.2 g，F(xiàn)eCl3·6H2O 8.0 g，MnCl2·4H2O 10.0 g，CoCl2·6H2O 1.0 g，去離子水定容至100 mL。緩沖溶液(B液)：NH4HCO34.0 g，NaHCO335.0 g，去離子水定容至1 000 mL。常量元素溶液(C液)：Na2HPO45.7 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，KH2PO46.2 g，去離子水定容至1 000 mL。刃天青溶液：0.1%。還原劑溶液：1 mol/L NaOH 4.0 mL，Na2S·9H2O 0.625 g，去離子水定容至100 mL。

1.4 瘤胃液采集與處理

晨飼前，從瘺管中取出瘤胃內(nèi)容物用4層尼龍紗布分離液體和固體部分。將5頭羊的瘤胃液混合均勻，迅速轉(zhuǎn)入經(jīng)39 ℃預(yù)熱并充滿CO2的保溫瓶，快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將70 g(濕重)固體接種物裝進(jìn)尼龍袋中(14 cm×7 cm，孔徑50 μm)并緊密塑封。試驗(yàn)第1天，每個(gè)罐接種320 mL瘤胃液和320 mL人工唾液，之后在發(fā)酵罐中放入兩個(gè)尼龍袋，其中一個(gè)裝有日糧和不同聚合度殼聚糖(20 mg/g)，另一個(gè)裝入瘤胃固體接種物。日糧為奶山羊所用飼料，在8～11 d換料后0、2、4、8、12、24 h采集12 mL發(fā)酵

表1 日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the diet (DM basis)

注：每千克預(yù)混料含有: 石粉476.0 g， FeSO4·7H2O 25.38 g，CuSO4·5H2O 13.45 g，MnSO4·H2O 12.56 g，ZnSO4·7H2O 40.20 g，CoCl2·6H2O 83 mg，Na2SeO345 mg，KI 66 mg，VA 3×106IU，VD37.8×105IU，VE 3×103IU。營養(yǎng)水平為實(shí)際測定值。

Note: Vitamin-mineral premix (per kg): limestone 476.0 g， FeSO4·7H2O 25.38 g，CuSO4·5H2O 13.45 g，MnSO4·H2O 12.56 g，ZnSO4·7H2O 40.20 g，CoCl2·6H2O 83 mg，Na2SeO345 mg，KI 66 mg，VA 3×106IU，VD37.8×105IU，VE 3×103IU.Nutrient levels were measured values.

液用于VFA等指標(biāo)的測定。揮發(fā)性脂肪酸測定采用氣相色譜儀(Agilent 7820A GC)，方法參考Zhao等[15]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件中一般線性分析中的單因素重復(fù)測量方差分析，用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表2可知，飼料中添加不同粘度的殼聚糖能夠增加丙酸比例(P<0.05)，降低乙丙比(P<0.05)、丁酸(P<0.05)和異戊酸的比例(P<0.01)，且中、低聚合度殼聚糖作用效果優(yōu)于高聚合度殼聚糖。殼聚糖對乙酸、異丁酸、戊酸、總揮發(fā)酸生成量無顯著影響(P>0.05)。發(fā)酵液乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸比例及乙丙比均隨著時(shí)間發(fā)生變化(P<0.05)，總酸生成量不受時(shí)間影響(P>0.05)。時(shí)間和處理之間不存在協(xié)同作用(P> 0.05)。

2.2 殼聚糖對不同時(shí)間點(diǎn)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的變化

如圖1A～C所示，隨著時(shí)間的變化，發(fā)酵液中各組間乙酸、丙酸和乙丙比的變化趨勢一致。乙酸比例從2 h到8 h呈增加趨勢，并且在8 h達(dá)到最大值53.64 %。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，不同處理組間乙酸比例無顯著差異。丙酸比例從0～6 h緩慢下降，到6 h達(dá)到最低，之后緩慢上升。在任一時(shí)間點(diǎn)，中、低聚合度殼聚糖組丙酸比例均顯著高于對照組(P<0.05)，而乙丙比顯著低于對照組(P<0.05)。高聚合度殼聚糖也有顯著增加丙酸比例、降低乙丙比的效果，但效果不如中、低聚合度殼聚糖。從圖1D和圖1G可知，中、低聚合度的殼聚糖均能顯著降低丁酸和異戊酸比例(P<0.05)，且兩組之間差異不顯著。從圖1E、1F和1H可知，殼聚糖對異丁酸、戊酸比例和總揮發(fā)酸濃度沒有顯著影響(P>0.05)。

注：同行肩標(biāo)不同字母者差異顯著(P<0.05)，C代表殼聚糖。下同。

Note: Different lowercase superscripts in the same row mean significant difference (P<0.05), C stands for chitosan, the same below.

3 討 論

3.1 不同粘度殼聚糖對瘤胃發(fā)酵的影響

殼聚糖是一種天然綠色的生物聚合物，能夠在自然界安全地降解[16]。在反芻動(dòng)物中，VFA的濃度反映了瘤胃供能的能力[17]。葡萄糖在瘤胃中氧化為乙酸、丙酸和丁酸，分別為機(jī)體提供的能量為原來能量(2 805 kJ/mol)的 62%、109%和 78%，可見瘤胃進(jìn)行丙酸型發(fā)酵時(shí)供能效率最高[13]。大量體內(nèi)[9,18]和體外試驗(yàn)[19]已證實(shí)殼聚糖可促進(jìn)丙酸合成，使瘤胃的發(fā)酵類型從乙酸型發(fā)酵向丙酸型發(fā)酵轉(zhuǎn)變，降低瘤胃甲烷的排放，促進(jìn)粗飼料的降解，從而提高飼料利用率，這也是目前飼料添加劑降低反芻動(dòng)物甲烷排放的主要作用機(jī)理之一[20]。但目前研究殼聚糖對瘤胃發(fā)酵以及微生物影響的試驗(yàn)，結(jié)果存在一定差異，甚至相反。李宗軍[13]的研究表明，殼聚糖可增強(qiáng)瘤胃丙酸發(fā)酵通路，降低乙丙比，減少甲烷的排放。Mingoti[21]發(fā)現(xiàn)在奶牛飼喂不同濃度的殼聚糖時(shí)，瘤胃中丙酸的濃度隨殼聚糖濃度呈線性增加。李朝云[19]的試驗(yàn)表明，殼聚糖在低(20：80)、中精粗比(50：50)的日糧中，能夠顯著增加丙酸的含量；而在高精料(80：20)條件下，能夠顯著抑制乙酸生成，促進(jìn)丁酸含量的增加。殼聚糖還可以改變瘤胃內(nèi)菌群的結(jié)構(gòu)[22]，提高微生物蛋白的合成，加速纖維的降解[23]，抑制革蘭氏陽性菌的生長，進(jìn)而減少乙酸的生成。而主要產(chǎn)物為丙酸的擬桿菌門和變形桿菌門都是革蘭氏陰性菌[24]。Chung[14]則認(rèn)為革蘭氏陰性菌對殼聚糖的敏感性要高于革蘭氏陽性菌。在體外試驗(yàn)中，水溶性殼聚糖能夠有效抑制奶牛體內(nèi)的大腸桿菌及沙門氏菌[12]。而Tokura[25]的研究則表明，不同聚合度的殼聚糖對大腸桿菌的敏感性并不一致，低聚合度殼聚糖表現(xiàn)為明顯促進(jìn)大腸桿菌的生長。有研究表明，殼聚糖攜帶的質(zhì)子化銨，可以在弱酸性環(huán)境中被電離使其帶正電荷，它可以與細(xì)菌細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷接觸，破壞細(xì)菌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，并抑制細(xì)菌的生長[26]。各試驗(yàn)結(jié)果的不一致甚至相反可能是由于影響殼聚糖抗菌能力的因素較多，包括分子量、pH和金屬離子等[27]。由于革蘭氏陽性菌表面帶負(fù)電荷，高分子量殼聚糖可形成帶正電荷的絮凝，聚集于革蘭氏陽性菌表面影響細(xì)菌對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。分子量更低的殼聚糖進(jìn)入菌體內(nèi)部被酶解成為營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)細(xì)菌生長。而pH越低，殼聚糖抗菌能力更強(qiáng)。若分子量過高，可能抑制了產(chǎn)丙酸的革蘭氏陰性菌生長，造成丙酸產(chǎn)量的下降，進(jìn)而造成甲烷排放的增加[28-29]。

本試驗(yàn)中不同聚合度的殼聚糖均可增加丙酸的產(chǎn)量，降低乙丙比，而中、低聚合度相對于高聚合度的殼聚糖的作用效果更加明顯，這可能由于更低分子量的殼聚糖更多地進(jìn)入產(chǎn)丙酸的革蘭氏陰性菌菌體內(nèi)部提供了更多的營養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)其生長。較高分子量的殼聚糖進(jìn)入革蘭氏陰性菌菌體內(nèi)部后與帶負(fù)電荷的遺傳物質(zhì)相結(jié)合而起到抑菌作用效果可能增大，從而降低殼聚糖作為營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)丙酸生成的效果，甚至可能總體上起到抑制丙酸生成的作用，這有待進(jìn)一步試驗(yàn)探究。因此，實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)考慮殼聚糖聚合度的影響。中、低粘度殼聚糖在經(jīng)濟(jì)效益上同樣優(yōu)于高粘度殼聚糖，生產(chǎn)中可優(yōu)先選擇中、低聚合度殼聚糖用于調(diào)控反芻動(dòng)物瘤胃發(fā)酵。

3.2 殼聚糖對不同時(shí)間點(diǎn)瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

從時(shí)間軸上看，殼聚糖對全時(shí)間段乙酸的生成無顯著影響。這與張婕[30]結(jié)果一致。而Belanche[31]則在研究中發(fā)現(xiàn)，殼聚糖顯著降低體外發(fā)酵液中乙酸的產(chǎn)量。出現(xiàn)不同的結(jié)果可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)選擇的三種聚合度殼聚糖都為低分子量殼聚糖，對細(xì)胞壁較薄的革蘭氏陰性菌影響較大而對生成乙酸的革蘭氏陽性菌的抗菌作用較小。各時(shí)間段中、低粘度殼聚糖組丙酸的比例均顯著高于對照組，乙丙比均顯著低于對照組，說明中、低聚合度殼聚糖進(jìn)入瘤胃后全天內(nèi)均能起到促進(jìn)丙酸生成、降低乙丙比的作用，而作用效果所持續(xù)時(shí)間需進(jìn)一步試驗(yàn)確定。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，日糧中添加3種不同聚合度殼聚糖均能夠顯著地改變瘤胃發(fā)酵的模式，促進(jìn)丙酸的生成，使瘤胃的發(fā)酵方式向更高能量利用率的方向進(jìn)行。在調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵效果和經(jīng)濟(jì)效益方面，中、低聚合度殼聚糖(聚合度<400 mPa·s)在調(diào)節(jié)瘤胃的發(fā)酵模式上有更顯著的作用。