馬文鋒,毛 培,劉蘆鵬,王占彬,朱艷芝,張 邦,郭亮

(1.河南科技大學(xué) 動物科技學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.蘭州大學(xué) 草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；3.天津農(nóng)學(xué)院 動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384)

小麥中蛋白質(zhì)和氨基酸的含量高于玉米30%以上，在配制飼糧時可以用小麥替代部分玉米[1]。然而，小麥含有大量的非淀粉多糖，如木聚糖、果膠糖、纖維素等，這些多糖主要呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與水分子結(jié)合后提高了動物腸道食糜的粘度，進而抑制小腸對營養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率[1-2]。豬屬于單胃動物，機體不能分泌相關(guān)酶，不能高效地利用這一類多糖物質(zhì)[2]。研究表明，日糧中添加專一性強的酶制劑，可以減少非淀粉多糖對動物的抗?fàn)I養(yǎng)作用[3-5]。

在含有小麥、豆粕、麩皮等飼糧中添加木聚糖酶和果膠酶，可以破壞植物細胞壁，同時將一部分木聚糖和果膠分解為小分子單糖，進而減少腸道的代謝負擔(dān)[5-7]。在評估酶制劑的作用效果時，可以采用動物試驗和體外酶解試驗兩種方法。由于動物試驗的周期較長，生長試驗結(jié)果易受動物日齡和品種的影響，可以優(yōu)先進行體外試驗的初步評估，進而提高飼用酶制劑的開發(fā)效率。也有研究表明，非淀粉多糖酶的作用效果與飼料原料的組成與比例存在一定的計量關(guān)系[5-7]。因此，可以通過體外酶解試驗分別研究不同單一類型的非淀粉多糖酶對動物日糧的體外酶解效果，篩選到適宜的酶制劑再進行復(fù)合酶的效果評定。本試驗主要通過體外酶解的方法，模擬豬的胃腸道消化環(huán)境，研究木聚糖酶和果膠酶對小麥-玉米-豆粕型日糧營養(yǎng)物質(zhì)酶解效率的影響，為這兩種酶的合理使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 酶制劑

試驗所用木聚糖酶和果膠酶均為單酶，購自河南仰韶生化工程有限公司。酶活性為：木聚糖酶100 000 U/g、果膠酶30 000 U/g。

1.2 試驗設(shè)計及日糧組成

本試驗采用單因子試驗設(shè)計，每個單酶分別設(shè)置5個濃度梯度，每個梯度分別設(shè)置5個重復(fù)，其中木聚糖酶的添加濃度分別為10、30、50、70、90 U/g，果膠酶的添加濃度分別為3、6、9、12、15 U/g。

試驗日糧組成及營養(yǎng)成分見表1。利用粉碎機對混合后的飼料粉碎，至95%以上過60目篩網(wǎng)，置于包裝袋內(nèi)密封，備用。

表1 試驗日糧組成和營養(yǎng)成分Table 1 Ingredient composition of the experimental diets

注：①日糧無額外添加微量元素、氨基酸及礦物質(zhì)等；②消化能為計算值，其他均為實測值。

Note: ①The diet has no additional trace elements, amino acids and minerals; ②DE is calculated，others are measured.

1.3 主要試劑

緩沖溶液：0.1 mol/L HCL-54 mmol/L NaCL溶液(pH 2.0)，0.1 moL/L磷酸緩沖液(pH 7.0)，胰蛋白復(fù)合酶(Sigma，P7545)溶液(pH 6.8)。

1.4 體外酶解操作過程

準(zhǔn)確稱取1 g飼料樣品，放入150 mL三角瓶中，加入20 mL HCL-NaCL緩沖液(0.1 mol/L，pH 2.0)和0.1 g的胃蛋白酶(Sigma，P7000)。在厭氧條件下，將三角瓶置于39 ℃恒溫搖床內(nèi)，70 r/min振蕩6 h；取出三角瓶打開封口膜，準(zhǔn)確加入20 mL磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)和2.5 mL胰蛋白復(fù)合酶溶液，在溶液pH為7.0時，置于39 ℃恒溫搖床，70 r/min震蕩24 h；取出三角瓶中透析袋，室溫靜置20 min，取上清液檢測還原糖含量，酶解殘渣烘干后檢測干物質(zhì)和粗蛋白含量。

還原糖生成量(mg/g)=(C×VT)/(m×VS) ×1000

其中:C.標(biāo)準(zhǔn)曲線所查糖量(mg)；VT.提取液的體積(mL)；m.樣品的質(zhì)量(g)；VS.測定時的溶液體積(mL)。

干物質(zhì)酶解率(%)=(M0-M1)/M0×100

粗蛋白質(zhì)酶解率(%)=(M0×CP0-M1×CP1)/(M0×CP0)×100

其中:M0.飼料樣品干物質(zhì)重量(g)；M1.未酶解殘渣干物質(zhì)重量(g)；CP0.飼料樣品粗蛋白含量(%)；CP1.未酶解殘渣粗蛋白含量(%)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SAS(2001)中GLM模型進行數(shù)據(jù)分析，通過線性(Linear)和二次(Quadratic)效應(yīng)評估不同濃度木聚糖酶和果膠酶對日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白酶解效率的影響，處理間顯著性判定水平為P<0.05，數(shù)據(jù)平均值以LSMEANS表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 木聚糖酶對日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白酶解效率的影響

添加木聚糖酶對日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白酶解率的影響見表2。由表2可知，試驗日糧中添加木聚糖酶時，提高了試驗日糧的還原糖生成量(線性和二次，P<0.05)和粗蛋白質(zhì)酶解率(線性和二次，P<0.05)。當(dāng)木聚糖酶添加量分別為50、70、90 U/g時，還原糖生成量顯著高于對照組和其它低劑量添加組(P<0.05)。

表2 添加木聚糖酶對日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白酶解率的影響Table 2 The effects of xylanase on the reducing sugar production, enzymolysis efficiency of dry matter and crude protein in the diet

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)為相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

Notes:In the same row, values with the same or no superscripts mean insignificant difference (P>0.05), different lower-case letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same below.

根據(jù)體外酶解試驗結(jié)果，建立還原糖生成量和粗蛋白質(zhì)酶解率(Y，%)與木聚糖酶添加水平(X，U/g)的回歸方程，回歸方程及相關(guān)參數(shù)見表3和表4。由表3和表4可知，隨著日糧中木聚糖酶添加比例的提高，粗蛋白質(zhì)酶解率和還原糖生成量分別與木聚糖酶含量存在線性和二次關(guān)系，其中兩個線性方程的相關(guān)系數(shù)較高。木聚糖酶的最佳添加量通過線性方程推導(dǎo)：以粗蛋白質(zhì)酶解率為評價指標(biāo)，方程為Y=86.82-0.11(49.45-x)，相關(guān)系數(shù)為0.97，推導(dǎo)得出的木聚糖酶最適添加量為49.4 U/g；以還原糖生成量為評價指標(biāo)，方程為Y=45.54-0.247(66.31-x)，相關(guān)系數(shù)為0.93，推導(dǎo)得出的木聚糖酶最佳添加量為66.3 U/g。

表3 木聚糖酶添加水平與粗蛋白質(zhì)酶解率的關(guān)系Table 3 The correlation between the additional level of xylanase with enzymolysis efficiency of crude protein

表4 木聚糖酶添加水平與還原糖生成量的關(guān)系Table 4 The correlation between the additional level of xylanase with reducing sugar production

2.2 果膠酶對日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白酶解效率的影響

由表5可知，添加果膠酶對試驗日糧干物質(zhì)和粗蛋白酶解率無顯著影響(P>0.05)；當(dāng)果膠酶的添加量為12 U/g時，還原糖生成量顯著高于對照組和果膠酶低劑量(3 U/g)添加組(P<0.05)。根據(jù)體外酶解試驗結(jié)果，建立還原糖生成量(Y，%)與果膠酶添加水平(x，U/g)的回歸方程(Y=-0.20x2+3.93x+28.79)(R2=0.91)。根據(jù)二次方程推導(dǎo)得出果膠酶最佳添加量為9.8 U/g。

表5 果膠酶對日糧還原糖生成量、干物質(zhì)和粗蛋白酶解效率的影響Table 5 The effects of pectinase on the reducing sugar production, enzymolysis efficiency of dry matter and crude protein in the diet

3 討 論

評定酶制劑對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的作用效果主要采用體內(nèi)法和體外酶解法。體內(nèi)法可以較為準(zhǔn)確地反映動物對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用率，但因其試驗周期較長，受到外界的影響較多，造成其試驗結(jié)果的變異性較大[7-9]。近年來，酶制劑的體外評價方法逐漸被認(rèn)可，由于體外酶解法受到的干擾因素較少，試驗條件可控，試驗結(jié)果的重復(fù)性較高，目前已被廣泛用于飼用酶制劑的效應(yīng)評價[7-9]。

目前，我國常見的飼糧類型為玉米-豆粕型。近年來，隨著非淀粉多糖酶在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用，一定程度上減少了抗?fàn)I養(yǎng)因子對動物生產(chǎn)帶來的不良影響，也相應(yīng)提高了日糧原料的營養(yǎng)物質(zhì)消化率，為生豬日糧類型的復(fù)雜化提供了可能[12-13]。胡向東等[14]研究表明當(dāng)日糧中含有40%的小麥含量時，添加木聚糖酶可以獲得與玉米-豆粕組生長豬相近的生長性能。王利等[15]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)日糧的小麥含量達到60%時，補充適宜比例的木聚糖酶可以獲得高于玉米-豆粕組生長豬的粗蛋白質(zhì)和有機物消化率。然而也有一些研究認(rèn)為，當(dāng)小麥的添加量超過日糧配比的50%～60%后，補充木聚糖酶不能完全獲得玉米-豆粕型日糧的營養(yǎng)物質(zhì)利用率[14]。造成這一結(jié)果的原因，可能是由于木聚糖是小麥的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子之一，它主要存在于種皮中，是構(gòu)成細胞壁的主要成分。木聚糖具有很強的吸水力，其主鏈相連接的β-1，4-糖苷鍵結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，而單胃動物體內(nèi)缺乏用于降解木聚糖的酶類。因此，當(dāng)日糧中小麥數(shù)量較高時，需要在日糧中添加專一性的木聚糖酶來提高小麥型日糧的營養(yǎng)利用率。木聚糖酶作為木聚糖降解體系中最關(guān)鍵的多組分酶系，目前在飼料行業(yè)得到了廣泛應(yīng)用。因此，本次試驗設(shè)定日糧的小麥含量為50%，將其作為小麥型日糧的模擬配方進行研究，發(fā)現(xiàn)添加木聚糖酶可以提高小麥型日糧的還原糖生成量和粗蛋白質(zhì)酶解效率，同時與木聚糖酶的添加水平存在一定的劑量效應(yīng)。本試驗結(jié)果表明，在針對木聚糖酶的體外評價研究中，試驗日糧的小麥含量的差異可能是影響木聚糖酶適宜添加量的主要因素[14-15]。

果膠是一種高分子多糖化合物，廣泛存在于餅粕類蛋白質(zhì)原料的初生壁，其在豆粕中含量較高[16]。另外，果膠與纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素相互交聯(lián)，在植物組織細胞中發(fā)揮一定的粘合作用，可以將大分子營養(yǎng)物質(zhì)包裹在植物細胞壁，阻礙動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[16]。在飼糧中補充果膠酶，可以解離植物細胞壁并釋放出淀粉、蛋白質(zhì)和脂類等營養(yǎng)物質(zhì)，提高動物的營養(yǎng)物質(zhì)利用率[17]。目前，針對果膠酶的體外試驗主要集中在研究果膠酶對不同單一原料底物的體外酶解作用，較少探討果膠酶對全價日糧的酶解效果，因此本試驗的營養(yǎng)底物主要模擬小麥型全價日糧的配方組成。由于日糧類型及原料含量的變化，關(guān)于果膠酶的不同體外酶解結(jié)果可能存在較大的差異。本次試驗結(jié)果表明，添加果膠酶提高了小麥型日糧的還原糖生成量，但是對于日糧的粗蛋白質(zhì)和干物質(zhì)酶解效率無明顯改善作用，相關(guān)原因尚需要進一步的研究。

4 結(jié) 論

木聚糖酶添加量為50、70、90 U/g時，還原糖生成量顯著高于對照組和其它低劑量添加組；果膠酶添加量為12 U/g時，還原糖生成量顯著高于對照組和3 U/g添加組；木聚糖酶添加濃度由10 U/g提高至90 U/g時，顯著提高了小麥-玉米-豆粕型的還原糖生成量和粗蛋白質(zhì)酶解率；果膠酶添加濃度由3 U/g提高至15 U/g時，顯著提高了還原糖生成量。