黃仕千 農(nóng)揚 楊昭遠(yuǎn) 張鑫 俸祥仁 劉偉

（1，廣西百色市田陽區(qū)那滿鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站 533600；2，廣西壯族自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所 530001；3，廣西南寧市江南區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所 530000；4，廣西南寧市動物園 530000；5，廣西南寧強微農(nóng)牧科技有限公司 530001；6，廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 530001）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS） 由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV） 引起的一種急性接觸性傳染病，主要引起妊娠母豬的繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀[1,2]。豬傳染性胃腸炎是由冠狀病毒科冠狀病毒屬的豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV） 引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，以嘔吐、嚴(yán)重腹瀉、脫水、2 周齡內(nèi)仔豬高死亡率為特征，通常死于脫水和電解質(zhì)代謝紊亂[3]。目前，豬繁殖與呼吸綜合征和豬傳染性胃腸炎兩種病毒性疾病在我國廣泛存在，給養(yǎng)殖業(yè)造成了極大的危害。本試驗通過對復(fù)方金連菊中藥溶液體外抑制PRRSV、TGEV 的活性進(jìn)行初步研究，旨在為臨床上控制兩種疫病提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗藥物

復(fù)方金連菊中藥溶液由廣西南寧強微農(nóng)牧科技有限公司與廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所聯(lián)合研制[4,5]，規(guī)格： 1g 原藥材/ml。

1.1.2 毒株、細(xì)胞

PRRSV，Marc-145 傳代細(xì)胞，PK-15 傳代細(xì)胞，TGEV 均為廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所病毒研究室提供。

1.1.3 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、小牛血清、胰蛋白酶（0.25%）、NaHCO3、雙抗（青霉素80 萬單位、鏈霉素80 單位）

1.2 方法

（1） PRRSV、TGEV 病毒毒力測定（TCID50）。按殷震[6]方法、馮曉巍[3]方法將Marc-145 傳代細(xì)胞進(jìn)行消化傳代，細(xì)胞數(shù)調(diào)整至2×105個/ml，加到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100ul/孔，置于5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長成單層后，接種用DMEM 細(xì)胞維持液稀釋的濃度分別為10-1～10-12 的PRRSV病毒液，100ul/孔，每個稀釋度接種5 孔，5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h，每天觀察CPE 產(chǎn)生情況。

將PK-15 傳代細(xì)胞同上述方法進(jìn)行，待細(xì)胞長成單層后，接種用1640 細(xì)胞維持液稀釋的濃度分別為10-1～10-12的PRRSV病毒液。按Reed-Muench 公式計算TCID50[7-9]。

（2） 對Marc-145 傳代細(xì)胞，PK-15 傳代細(xì)胞安全濃度的測定。按馮曉巍[3]方法取對數(shù)生長期的細(xì)胞株，細(xì)胞數(shù)調(diào)整為2×105個/ml，加入96 孔板中，100ul/孔。置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃，待貼壁長成單層后將藥液用2%DMEM 細(xì)胞維持液連續(xù)的倍比稀釋后，加到已長成單層的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，藥液濃度見表1。并設(shè)正常細(xì)胞對照組，每個濃度重復(fù)5 孔，置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察CPE 情況，96h 后棄培養(yǎng)液上清部分，每孔加入含5mg/ml 噻唑藍(lán)（MTT） 的2%DMEM 細(xì)胞維持液30ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h 后，棄MTT 上清，每孔加溶解液二甲基亞砜（DMSO） 100ul，室溫震蕩10min 使結(jié)晶物溶解，然后用酶聯(lián)免疫吸附法檢測儀在570nm 波長處測定吸光度值。

對PRRSV、TGEV 的阻斷作用測定。按馮曉巍[3]方法將藥液用2%DMEM （TGEV 用10%和2%1640） 細(xì)胞維持液作連續(xù)的倍比稀釋的藥液濃度，分別加到長滿單層Marc-145 傳代細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，100ul/孔，每個稀釋度重復(fù)5 孔。37℃作用4h，棄去藥液，每個孔加入100TCID50病毒液，100ul/孔，另設(shè)細(xì)胞對照組和病毒對照組。5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，每天觀察CPE，當(dāng)病毒CPE 達(dá)到“+++或++++” 時，按MTT 吸收法用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm 波長處測定各孔吸光度值（OD570）。

對PRRSV、TGEV 的抑制作用測定。按馮曉巍[3]方法將100TCID50病毒液接種至長成單層Marc-145 傳代細(xì)胞的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，100ul/孔，37℃吸附2h，棄去病毒液，加入2%DMEM （TGEV 用10%和2%1640） 細(xì)胞維持液作連續(xù)的倍比稀釋的藥液濃度，100ul/孔，每個稀釋度重復(fù)5 孔，另設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照。5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，每天觀察CPE，當(dāng)病毒CPE 達(dá)到“+++或++++” 時，按MTT 吸收法用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm 波長處測定各孔吸光度值。

表1 中藥提取物抑菌濃度與對應(yīng)的藥物稀釋倍數(shù)關(guān)系

對PRRSV、TGEV 的直接殺滅作用測定。按馮曉巍[3]方法將各個稀釋度的藥液分別與等體積100TCID50病毒液混合，37℃作用2h，加到長成單層Marc-145 的96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，100ul/孔，每個稀釋度重復(fù)5 孔，另設(shè)細(xì)胞對照和病毒對照。5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，每天觀察CPE，當(dāng)病毒CPE 達(dá)到“+++或++++” 時，按MTT 吸收法用酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定各孔吸光度值。

1.3 藥物對抗病毒感染細(xì)胞的指標(biāo)計算

細(xì)胞存活率（%）=藥物組OD570/正常細(xì)胞組OD570×100

抑制率（%）=（藥物組OD570-病毒對照組OD570）/病毒對照組OD570×100

1.4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007 進(jìn)行整理，用DPS 進(jìn)行單因素方差分析，并以Duncan's 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRRSV、TGEV 病毒毒力測定（TCID50）

經(jīng)實驗測得PRRSV 的病毒毒力（TCID50） 為10.05.5/0.1ml，TGEV 病毒毒力為10.05.25/0.1ml。以下病毒接種量均為100TCID50。

2.2 復(fù)方金連菊中藥制劑對Marc-145 傳代細(xì)胞，PK-15 傳代細(xì)胞的安全濃度0D570 值

由表2 可知，根據(jù)MTT 法測得復(fù)方金連菊中藥的藥液濃度為62.5mg/ml 時與正常細(xì)胞對照組OD570值相近，且相比較差異不顯著（P＞0.05）。復(fù)方金連菊中藥的藥液濃度為31.25mg/ml、15.625mg/ml、7.8125mg/ml 和3.90625mg/ml 時OD570值與正常細(xì)胞對照組相近，且相比較差異不顯著（P＞0.05）。比較復(fù)方金連菊中藥制劑對Marc-145 傳代細(xì)胞和PK-15 傳代細(xì)胞的OD570值與正常細(xì)胞對照組最相近者為最大安全濃度即62.5mg/ml、31.25mg/ml。

2.3 復(fù)方金連菊中藥制劑對PRRSV、TGEV 感染細(xì)胞的阻斷作用

表2 復(fù)方中草藥制劑對Marc-145 細(xì)胞、PK15 細(xì)胞的安全濃度

由表3 可知，復(fù)方金連菊中藥制劑的藥液濃度為500、250、125、62.5、31.25、15.625 和7.8125mg/ml 各孔吸光度值（OD570） 與正常細(xì)胞對照組吸光度值（OD570）、病毒對照組吸光度值（OD570） 相比較差異極顯著（P＜0.01）；說明藥液濃度為500mg/ml～7.8125mg/ml 對PRRSV、TGEV 感染細(xì)胞的阻斷作用顯著。

藥液濃度為3.90625mg/ml 的吸光度值（OD570） 與正常細(xì)胞對照組相比較差異極顯著（P＜0.01），與病毒對照組相比較差異不顯著（P＞0.05）；說明藥液濃度為3.90625mg/ml 對PRRSV、TGEV 感染細(xì)胞的阻斷作用不顯著。

由表4 可知，復(fù)方金連菊中藥制劑的藥液濃度為500、250、125、62.5、31.25 和15.625mg/ml 各孔吸光度值（OD570）與正常細(xì)胞對照組吸光度值（OD570）、病毒對照組吸光度值（OD570） 相比較差異極顯著（P＜0.01）；說明藥液濃度為500～15.625mg/ml 對PRRSV、TGEV 感染細(xì)胞的阻斷作用顯著。藥液濃度為7.8125 和3.90625mg/ml 的吸光度值（OD570） 與正常細(xì)胞對照組相比較差異極顯著（P＜0.01），與病毒對照組相比較差異不顯著（P＞0.05），說明藥液濃度為7.8125 和3.90625mg/ml對PRRSV、TGEV 感染細(xì)胞的阻斷作用不顯著。

2.4 復(fù)方金連菊中藥制劑對PRRSV、TGEV 增殖的抑制作用

由表3 可知，復(fù)方金連菊中藥制劑溶液濃度為500、250、125、62.5、31.25 和15.625mg/ml 對PRRSV 在Marc-145 傳代細(xì)胞上的增殖具有極顯著的抑制作用（P＜0.01），藥液濃度為3.90625mg/ml 對PRRSV 在Marc-145 傳代細(xì)胞上的增殖具有顯著的抑制作用（P＜0.05）。

由表4 可知，復(fù)方金連菊中藥制劑溶液濃度為500、250、125 和62.5mg/ml 對TGEV 在PK-15 傳代細(xì)胞上的增殖具有極顯著的抑制作用 （P＜0.01）；藥液濃度為31.25、15.625、7.8125 和3.90625mg/ml TGEV 在PK-15 傳代細(xì)胞上的增殖具有顯著的抑制作用（P＜0.05）。

表3 復(fù)方中草藥制劑對PRRSV 的體外作用

表4 復(fù)方中草藥制劑對TGEV 的體外作用

2.5 復(fù)方金連菊中藥制劑對PRRSV、TGEV 的直接殺滅作用

由表3 可知，藥液濃度在500～3.90625mg/ml 范圍內(nèi)對PRRSV 具有極顯著的直接殺滅作用（P＜0.01）。

由表4 可知，藥液濃度在500～62.5mg/ml 范圍內(nèi)對TGEV具有極顯著的直接殺滅作用（P＜0.01）；藥液濃度在31.25～3.90625mg/ml 范圍內(nèi)能夠影響TGEV 對細(xì)胞的作用，但效果不明顯（P＞0.05）。

3 結(jié)論與討論

利用合適的病毒-細(xì)胞培養(yǎng)體系，采用MTT 法考察測試藥物對病毒增殖的影響，是常用體外篩選抗病毒藥物的手段之一。本試驗結(jié)果為復(fù)方金連菊中藥制劑體外抗PRRSV、TGEV活性提供了有力證據(jù)。試驗所用細(xì)胞均為8～14 代的細(xì)胞，病毒是在細(xì)胞中增殖的第二代病毒，以避免細(xì)胞和病毒的差異對結(jié)果的影響。

藥物抗病毒的作用機理，一般認(rèn)為是對途經(jīng)的，但主要有2 條途徑，一是直接殺滅病毒，二是抑制病毒的繁殖。本試驗?zāi)康氖怯^察樣品能否進(jìn)入細(xì)胞或吸附細(xì)胞表面以阻止病毒的吸附和進(jìn)入。試驗結(jié)果顯示： 復(fù)方金連菊中藥制劑溶液對Marc-145 細(xì)胞的最大濃度為62.5mg/ml，對PK15 細(xì)胞的最大濃度為31.25mg/ml，在安全濃度以下不明顯引起細(xì)胞損傷，對細(xì)胞無毒性作用。復(fù)方金連菊中藥制劑溶液濃度為500～7.8125mg/ml對PRRSV 感染細(xì)胞的阻斷作用極為顯著（P＜0.01），藥液濃度為3.90625mg/ml 對PRRSV 感染細(xì)胞的阻斷作用不明顯 （P＞0.05）；藥液濃度為500～15.625mg/ml 對TGEV 感染細(xì)胞的阻斷作用極為顯著 （P＜0.01），藥液濃度7.8125～3.90625mg/ml 對TGEV 感染細(xì)胞的阻斷作用不明顯（P＞0.05）；說明藥液濃度高于15.625mg/ml 分別能對抑制PRRSV 與Marc-145 傳代細(xì)胞和TGEV 與PK-15 傳代細(xì)胞的吸附、融合，從而阻止病毒的吸附和進(jìn)入。復(fù)方金連菊中藥制劑溶液濃度在500～3.90625mg/ml 范圍內(nèi)對PRRSV 具有極顯著的直接殺滅作用（P＜0.01），藥液濃度在500～62.5mg/ml 范圍內(nèi)對TGEV 具有極顯著的直接殺滅作用（P＜0.01）。說明復(fù)方金連菊中藥制劑具有一定的阻止病毒的吸附和進(jìn)入效果，但具體應(yīng)用尚需進(jìn)一步臨床試驗。