曾玉坤，劉 玲，羅曉輝，丁紅珂，余麗華，張 彥

(廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心,廣東廣州 511400)

杜氏肌營養(yǎng)不良癥是一種由DMD基因缺失、重復(fù)或點突變導(dǎo)致的致死性X連鎖隱性遺傳神經(jīng)肌肉疾病,DMD基因位于X染色體短臂Xp21處，是目前發(fā)現(xiàn)的人類最大的基因，發(fā)病率為1/3 500[1-3]。杜氏肌營養(yǎng)不良癥一般以男性多發(fā)，女性大多為致病基因攜帶者，主要臨床表現(xiàn)為進行性、對稱性肌無力，Gower征陽性，腓腸肌假性肥大。大多數(shù)患者在3～5歲發(fā)病，病情進展迅速，6歲以后出現(xiàn)行走困難，約10歲時多數(shù)患者就需使用輪椅生活，20～30歲時患者可因呼吸衰竭而死亡[3-5]，該病至今尚無治愈方法。目前，針對有杜氏肌營養(yǎng)不良癥家族史的家庭進行產(chǎn)前診斷是避免生育杜氏肌營養(yǎng)不良癥患兒的重要方法。多重連接依賴探針擴增(MLPA)技術(shù)是一種在單一反應(yīng)管內(nèi)同時檢測多達幾十個不同核苷酸序列拷貝數(shù)變異的檢測方法[6]。本研究采用MLPA技術(shù)對存在杜氏肌營養(yǎng)不良癥生育史的家庭進行基因診斷和產(chǎn)前診斷，進一步探討了MLPA技術(shù)的應(yīng)用價值，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年1月就診于本院產(chǎn)前診斷門診，臨床表現(xiàn)為運動功能減退和進行性肌無力，血清肌酸激酶(CK)水平顯著升高，基因檢測結(jié)果明確為DMD基因缺失或重復(fù)突變的杜氏肌營養(yǎng)不良癥患兒(先證者)為研究對象，納入標準：明確診斷為杜氏肌營養(yǎng)不良癥的患兒，且其母親再次妊娠，并要求進行產(chǎn)前診斷。最終納入14個家系包括先證者、先證者母親及胎兒共42例作為研究組。同時選取血清CK及肌電圖正常，臨床診斷排除杜氏肌營養(yǎng)不良癥的3例健康成年男性作為對照組(依據(jù)杜氏肌營養(yǎng)不良癥為X連鎖隱性遺傳的特點，排除該病的健康成年男性可排除患者及攜帶者的可能性，適于作為檢測時的內(nèi)對照使用)。研究組一般資料見表1。

表1 研究組一般資料

1.2方法

1.2.1DNA提取 抽取所有先證者及其母親外周靜脈血各2 mL，以乙二胺四乙酸二鉀抗凝。采用血液基因組DNA提取試劑盒(廈門致善生物科技股份有限公司)提取外周血標本基因組DNA，操作方法嚴格按照說明書進行。所有先證者母親再次妊娠時在妊娠中期抽取羊水或絨毛標本進行產(chǎn)前診斷，羊水和絨毛標本均采用Qiagen DNA MINI Kit 50試劑盒進行DNA提取，操作方法嚴格按照說明書進行。對照組采集外周靜脈血2 mL，與研究組同批次、使用同種方法提取DNA，于-20 ℃中保存?zhèn)溆?。上述提取的所有研究對象的全基因組DNA使用NanoDrop 2000分光光度計(美國Thermo公司)測得外周血DNA水平均大于100 ng/μL，羊水DNA和絨毛DNA水平均大于30 ng/μL，A260/A280為1.8～2.0。

1.2.2羊水和絨毛標本污染鑒別 提取的羊水DNA和絨毛DNA均采用熒光PCR毛細管電泳法檢測母親和胎兒第13、18、21號染色體上的13個微衛(wèi)星多態(tài)標記位點，用以對羊水和絨毛標本進行污染鑒別，防止漏診或因母源污染而引起的誤診。

1.2.3MLPA檢測及結(jié)果分析 使用SALSA MLPA P034-B2和P035-B1 DMD試劑盒(荷蘭MRC Holland公司)對研究對象進行拷貝數(shù)變異檢測。操作流程及后續(xù)數(shù)據(jù)分析方法按照試劑盒說明書進行，主要操作步驟，(1)變性：依據(jù)提取的標本基因組DNA水平使用相應(yīng)的試劑盒洗脫液將基因組DNA稀釋至5 μL(DNA總量為100～200 ng)，95 ℃變性5 min。(2)雜交：將變性后的基因組DNA冷卻至25 ℃，分別加入1.5 μL P034-B2和P035-B1探針，再加入1.5 μL MLPA Buffer，60 ℃雜交過夜(約16 h)。(3)連接：將溫度降至54 ℃，加入32 μL連接混合物(3 μL Buffer A、3 μL Buffer B、25 μL H2O、1 μL Ligase-65)，54 ℃連接15 min，然后98 ℃ 5 min終止連接反應(yīng)。(4)PCR擴增：溫度降至25 ℃，加入10 μL PCR混合物(7.5 μL H2O、2 μL PCR Primer mix、0.5 μL SALSA Polymerase)；PCR擴增條件為：95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個擴增循環(huán)；循環(huán)完成后于72 ℃再延伸20 min。(5)毛細管電泳分離及數(shù)據(jù)分析：PCR擴增產(chǎn)物通過ABI 3500毛細管電泳儀進行電泳分離，觀察各擴增產(chǎn)物電泳后的峰形圖，以對照組的檢測結(jié)果作為內(nèi)對照，對檢測的原始結(jié)果使用Coffalyser Net軟件(荷蘭MRC-Holland公司)進行分析。

2 結(jié) 果

本研究利用MLPA技術(shù)對14例先證者、先證者母親和胎兒進行了DMD基因所有外顯子拷貝數(shù)變異檢測，其中先證者拷貝數(shù)缺失突變13例，重復(fù)突變1例，10例先證者發(fā)生45～54號區(qū)域內(nèi)外顯子半合子缺失；家系1～8先證者拷貝數(shù)缺失或重復(fù)片段遺傳自其母親；胎兒拷貝數(shù)雜合缺失突變3例，雜合重復(fù)突變1例，其余10例胎兒未檢測到外顯子缺失或重復(fù)，未重復(fù)先證者基因型。見表2。

表2 14個家系DMD基因MLPA檢測結(jié)果

3 討 論

杜氏肌營養(yǎng)不良癥病死率高、預(yù)后不良，且至今尚無有效治療方法，給患者家庭和社會帶來了沉重的負擔。為了避免杜氏肌營養(yǎng)不良癥患兒的出生，針對有該病患兒生育史的家庭，在明確先證者致病基因及類型的前提下進行產(chǎn)前診斷是預(yù)防該病發(fā)生的有效手段[7]。

DMD基因位于染色體Xp21區(qū)，全長約2.4 Mb，有79個外顯子，編碼了3 685個氨基酸，組成相對分子質(zhì)量約為427×103的細胞骨架蛋白-抗肌萎縮蛋白[8]。DMD基因突變類型多樣，已報道的就有7 000余種[9]，其中主要以片段缺失最為常見，約占65%；其次為片段重復(fù)，約占10%；其他類型的致病突變包括點突變、微缺失等[10-11]。相關(guān)研究表明，雖然遺傳所致的DMD突變約占2/3，但新發(fā)突變占比高達1/3[12]，所以無杜氏肌營養(yǎng)不良癥生育史或家族史的家庭仍需要重視該病的可能發(fā)病風險。

本研究14個家系中先證者DMD基因拷貝數(shù)缺失突變13例，重復(fù)突變1例，且所檢測的拷貝數(shù)缺失、重復(fù)突變基本覆蓋該基因所有外顯子，其中第45～54號區(qū)域內(nèi)外顯子發(fā)生缺失的頻率相對較高，本研究的14例先證者中有10例的拷貝數(shù)缺失突變與此區(qū)域內(nèi)的外顯子有關(guān)，這與國內(nèi)相關(guān)文獻報道的熱點缺失區(qū)域相符[3,5]。8個家系中先證者的DMD基因缺失或重復(fù)片段遺傳自其母親，另有6個家系先證者均明確存在DMD基因缺失突變，但其母親并未攜帶相同的致病突變，這些患兒可能是由其母親卵子形成時DMD基因發(fā)生新發(fā)突變或其母親存在生殖細胞嵌合所致。按照《中國假肥大型肌營養(yǎng)不良癥診治指南》的建議，生育過杜氏肌營養(yǎng)不良癥患兒的母親再次妊娠時應(yīng)進行產(chǎn)前基因診斷[1]。

MLPA技術(shù)通過探針和靶序列DNA進行雜交、連接、PCR擴增、毛細管電泳分離及數(shù)據(jù)收集，再到后續(xù)的結(jié)果分析、得出結(jié)論，整個操作僅需1次反應(yīng)就可以檢測幾十個靶序列拷貝數(shù)的改變，因而相較于傳統(tǒng)針對79個外顯子區(qū)域進行逐個序列檢測的分析方法有了極大簡化，檢測效率得到了明顯提高。此外，由于特殊的檢測原理，MLPA技術(shù)檢測靈敏度與特異度也非常高，相關(guān)數(shù)據(jù)表明其檢測準確度高達99%[13]。MLPA檢測試劑盒的商業(yè)化生產(chǎn)也讓其檢測操作變得更加簡便、穩(wěn)定、重復(fù)性好。

MLPA技術(shù)雖然具備較多優(yōu)點，但仍存在不能檢測未知的點突變及平衡易位等局限性,如果探針結(jié)合序列內(nèi)存在點突變或微缺失等情況會導(dǎo)致外顯子缺失，檢測出現(xiàn)假陽性結(jié)果[14],因而對于臨床癥狀明顯，MLPA檢測陰性的受檢者，后續(xù)仍需要進行DNA測序以排除包括點突變、微缺失、微重復(fù)等其他突變類型。此外，鑒于MLPA技術(shù)會由于DNA變性不完全、鹽污染等因素而導(dǎo)致探針檢測信號的降低，使檢測結(jié)果所顯示的拷貝數(shù)比值處于臨界值區(qū)間內(nèi)，此種情況也需要進行重復(fù)檢測驗證，以保證結(jié)果的準確性[15]。

綜上所述，運用MLPA技術(shù)能快速、準確且相對簡便地檢測DMD基因所有外顯子拷貝數(shù)變異，這為有杜氏肌營養(yǎng)不良癥患兒生育史的家庭明確致病因素提供了有效手段，同時為這類具有再生育意愿的家庭避免再次生育杜氏肌營養(yǎng)不良癥患兒提供了科學(xué)的指導(dǎo)依據(jù)。