牛繼敏，牛金中,2,3，黃 瑜,2,3，簡(jiǎn)紀(jì)常,2,3，王 蓓,2,3，魯義善,2,3

羅非魚唾液酸黏附素基因克隆及組織表達(dá)

牛繼敏1，牛金中1,2,3，黃 瑜1,2,3，簡(jiǎn)紀(jì)常1,2,3，王 蓓1,2,3，魯義善1,2,3

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 // 2. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 //3. 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088）

【目的】研究尼羅羅非魚（）唾液酸黏附素（）在健康魚及感染無乳鏈球菌（）后的組織表達(dá)，探討其在免疫反應(yīng)中的作用。【方法】根據(jù)NCBI上公布的羅非魚唾液酸黏附素基因（GenBank登錄號(hào)LOC102078335，記為）克隆開放閱讀框序列，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)在健康羅非魚脾臟、頭腎、腸道、皮膚、鰓、腦、肌肉、肝、胸腺、脾、外周血中的分布，以及無乳鏈球菌（）刺激后的表達(dá)?！窘Y(jié)果與結(jié)論】基因編碼區(qū)1 617 bp，編碼538個(gè)氨基酸，理論分子質(zhì)量59.44 ku，等電點(diǎn)6.57。含有3個(gè)IG結(jié)構(gòu)域和1個(gè)IGC2，是IG結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)超級(jí)家族成員。多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，與其他物種氨基酸序列同源性介于36.81% ~ 92.94%，且與奈里樸麗魚（）同源性最高。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，與慈鯛科魚的聚為一支。在健康羅非魚各組織中均有表達(dá)，在頭腎和外周血中表達(dá)量最高，其余組織表達(dá)量相對(duì)較低。經(jīng)無乳鏈球菌刺激后，表達(dá)量在10個(gè)組織中均呈現(xiàn)顯著的時(shí)序性。

尼羅羅非魚；唾液酸黏附素；基因；克??；表達(dá)；無乳鏈球菌

尼羅羅非魚（）屬熱帶性魚類，其肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，具生長(zhǎng)與繁殖力強(qiáng)、抗病性和適應(yīng)能力強(qiáng)等特點(diǎn)，在我國(guó)南方地區(qū)廣泛養(yǎng)殖[1]。然而，隨著養(yǎng)殖密度的增加，養(yǎng)殖環(huán)境惡化，羅非魚相關(guān)病害也隨之增加，如無乳鏈球菌病、羅湖病毒病，給羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-6]。因此，研究羅非魚免疫系統(tǒng)及免疫應(yīng)答有重要意義，有助于其疫苗的研發(fā)。

唾液酸黏附素(又稱Siglec-1或CD169，屬于免疫球蛋白超家族類黏附分子，主要表達(dá)于單核巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上，參與單核巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的促炎癥反應(yīng)及T淋巴細(xì)胞的激活[7]。還可作為吞噬性受體結(jié)合和清除含唾液酸結(jié)構(gòu)的病原體[8]。哺乳動(dòng)物唾液酸黏附素分子質(zhì)量約185 ku，其結(jié)構(gòu)高度保守，胞外區(qū)域有17個(gè)免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域[9]，用于介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間黏附。胞內(nèi)缺乏用于信號(hào)傳導(dǎo)的免疫受體酪氨酸抑制基序（Immunoreceptor tyrosinebased inhibitory motifs，ITIM）。目前，有關(guān)魚類唾液酸黏附素的研究只是在基因組中預(yù)測(cè)該基因，而關(guān)于唾液酸黏附素與其配體的相互作用機(jī)制、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制以及其他生物功能仍未完全闡明。深入探索唾液酸黏附素的分子結(jié)構(gòu)和生物機(jī)制對(duì)于進(jìn)一步了解免疫調(diào)節(jié)機(jī)制、干預(yù)免疫調(diào)節(jié)過程均有重要意義。本研究基于羅非魚唾液酸黏附素基因（記作）在NCBI上公布預(yù)測(cè)的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，克隆與預(yù)期一致的開放閱讀框（ORF），并通過熒光定量PCR的方法對(duì)其組織表達(dá)模式，以及細(xì)菌刺激后該基因在羅非魚體內(nèi)的各個(gè)組織表達(dá)變化展開研究，以期初步了解唾液酸黏附素在羅非魚免疫系統(tǒng)中所發(fā)揮的作用，為后續(xù)蛋白純化、抗體制備提供技術(shù)支持，并為進(jìn)一步研究免疫球蛋白樣凝集素家族在硬骨魚先天免疫中的重要作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用尼羅羅非魚約150 g，采自廣東海洋大學(xué)東海島基地，在30℃左右條件下暫養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。大腸桿菌（）DH5 α和無乳鏈球菌（）ZQ0910菌種由由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。qPCR 試劑盒（TransStart Green qPCR SuperMix）、RNA提取試劑盒（TransZol Up Plus RNA Kit）、cDNA合成試劑盒（TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix）購自北京全式金公司。PCR引物由生工生物工程股份有限公司合成，Premix Taq? Version 2.0、載體pMD18-T購自TaKaRa公司（大連），DNA回收純化試劑盒（ThermoScientific GeneJET）購自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 羅非魚總RNA提取和cDNA合成 對(duì)無乳鏈球菌刺激組腹腔注射濃度為1×107cfu/mL的無乳鏈球菌0.1 mL，對(duì)照組腹腔注射0.1 mL的磷酸鹽緩沖液（PBS）[10]，各組分別在注射后0、6、12、24、48、72、96 h隨機(jī)取羅非魚3尾，取脾臟、頭腎、腸道、皮膚、鰓、腦、肌肉、肝、胸腺、脾、外周血等10個(gè)組織，放入TransZol中，根據(jù)TransZol Up Plus RNA Kit說明書提取羅非魚各組織RNA。按照北京全式金公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix說明書將羅非魚10組織總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于基因克隆和不同組織表達(dá)分析。

1.2.2 羅非魚基因的分子克隆 根據(jù)NCBI上公布的的基因序列(LOC102078335)，以1.2.1制備的羅非魚頭腎cDNA為模板，用PrimerPremier 5.0設(shè)計(jì)引物Sial-1F、Sial-1617R（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（20 μL）：Premix Taq 10 μL，ddH2O 7.5 μLcDNA 模板0.5 μL，Sial -1F、Sial-1617各1 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃5 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃60s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10min，4 ℃下保存[11]。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后對(duì)其進(jìn)行切膠回收，目的條帶與pMD 18-T載體連接，連接成功后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于Amp+的LB瓊脂平板上，倒置在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8 ~10 h，挑選單菌落于含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃、160r/min 條件下培養(yǎng)4 h，用通用引物M13和RV（表1）進(jìn)行菌落PCR鑒定，將陽性克隆送至生工生物公司測(cè)序。

表1 引物

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)的表達(dá) 參考文獻(xiàn)[12]方法。首先利用的特異性引物sial-RT595F、sial-RT758R（表1），以β-actin為內(nèi)參基因，用ABI 7500 Real-Time定量PCR儀檢測(cè)在各個(gè)組織以及不同刺激后的表達(dá)。qPCR參照TransStart Top Green qPCR SuperMix試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)體系：TransStart Top Green qPCR SuperMix 5 μL，10 μmol/L上下游引物各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，dH2O 3.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。用2-ΔΔCt法[13]計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.2.4 用軟件分析陽性克隆結(jié)果 對(duì)克隆獲得的序列用NCBI (https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行比對(duì)分析；利用TMHMM Server 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM) 預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域；用Inter ProScan Sequence search (http://www.ebi.ac.uk/Tools)和SMART (http://smart. embl-heidelberg.de/) 預(yù)測(cè)蛋白功能結(jié)構(gòu)域；用Clutalx和Genedoc軟件進(jìn)行氨基酸同源序列比對(duì)。蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)網(wǎng)址分別為PORTER (http://www.distill. ucd.ie/porter)、SWISSM-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/interactive)。使用ExPASy ProtParam tool (http://web.expasy.org/ protparam/）進(jìn)行On-sialoadhesin氨基酸序列推導(dǎo)和相關(guān)理化性質(zhì)分析。通過MEG7.0軟件，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 On-sialoadhesin基因克隆與序列分析

基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得與預(yù)期基因一致的片段，為1 617 bp（圖1），編碼538個(gè)氨基酸殘基。

M，DL2000 DNA 分子標(biāo)準(zhǔn); 1，目的基因

經(jīng)預(yù)測(cè)，第395～417位氨基酸存在跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2）；第1～17位為信號(hào)肽區(qū)域，其中信號(hào)肽剪切位點(diǎn)在第17～18位氨基酸之間；該序列功能位點(diǎn)（圖3）有細(xì)胞附著序列1個(gè)，N-糖基化位點(diǎn)6個(gè)，酪蛋白激酶 II 磷酸化位點(diǎn)12個(gè)，蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)9個(gè)，酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)3個(gè)，N-豆蔻?；稽c(diǎn)9個(gè)，C-末端靶向信號(hào)序列7個(gè)，異戊二烯基結(jié)合位點(diǎn)4個(gè)；蛋白的分子式為C2632H4095N717O818S18，分子質(zhì)量59.44 ku，理論等電點(diǎn)6.57，偏酸性，絲氨酸（Ser）13.6%，亮氨酸（Leu）8.4%，纈氨酸（Val）8.4%，蘇氨酸（Thr）6.5%，總平均親水性（GRAVY）為–0.323。半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數(shù)為44.24，脂肪指數(shù)為80.02，根據(jù)Guruprasad方法[14]，為不穩(wěn)定蛋白。

圖2 On-sialoadhesin基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列和功能位點(diǎn)

2.2 On-sialoadhesin蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖4可見，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，其中，α-螺旋53個(gè)，占總鏈的35.33%，無規(guī)則卷曲76個(gè)，占總鏈的50.67%，β-轉(zhuǎn)角18個(gè)占總鏈的12%，延伸鏈3個(gè)，占總鏈的2%。對(duì)蛋白進(jìn)行同源模建，獲其三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，其最佳模型是5lfu.1.A（圖5），序列一致性為20.87%；另一模型是3laf.1A，序列一致性為20.18%。

2.3 On-sialoadhesin序列同源比對(duì)及進(jìn)化分析

將克隆的基因序列與金頭鯛（）、伯氏樸麗魚（）、雀鳥（）、三趾箱龜（）、泰國(guó)斗魚（）、揚(yáng)子鱷（）、奈里樸麗魚（）、斑馬擬麗魚（）、大黃魚（）等相應(yīng)的基因序列進(jìn)行相似性比對(duì)，其中羅非魚與里樸麗魚序列相似性高達(dá)92.75%，與泰國(guó)斗魚序列相似性為67.85%（表2）。構(gòu)建的羅非魚唾液酸黏附素基因系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖6，結(jié)果顯示，尼羅羅非魚與同屬慈鯛科的樸麗魚屬和擬麗魚屬魚的親緣性最近，其次是泰國(guó)斗魚，而與揚(yáng)子鱷和三趾箱龜?shù)任锓N相距最遠(yuǎn)。羅非魚與慈鯛科各屬魚的聚為1支，同源性較高。

藍(lán)色是α-螺，紅色是β-轉(zhuǎn)角，綠色是延伸鏈，紫色是無規(guī)則卷曲

圖5 On-sialoadhesin蛋白蛋白跨膜區(qū)三維結(jié)構(gòu)

表 2 序列相似性

2.4 On-sialoadhesin在羅非魚各組織中的分布

的各組織表達(dá)檢測(cè)結(jié)果（圖7）顯示，在健康羅非魚的10個(gè)組織中均有表達(dá)，在頭腎和外周血中表達(dá)量最高，其余組織表達(dá)量較低。

圖6 鄰接法構(gòu)建的On-sialoadhesin進(jìn)化樹

L：肝；Hk：頭腎；Br：腦；In：腸；Sk：皮膚；M：肌肉；Sp：脾；Th：胸腺；G：鰓；B：外周血；On-sialoadhesin水平在肝臟中設(shè)為1

2.5 無乳鏈球菌攻毒后On-sialoadhesin在羅非魚組織中的表達(dá)

圖8可見，無乳鏈球菌攻毒后，在頭腎中，12、24 h時(shí)顯著升高（＜0.05），96 h時(shí)極顯著降低（＜0.01）。在腦組織中，攻毒后6 h顯著下降（＜0.05），12 h和48 h時(shí)顯著增加（＜0.01），24 h時(shí)恢復(fù)至正常水平，而在72、96 h時(shí)極顯著降低(< 0.01)。在皮膚中，6 h時(shí)極顯著增加（＜0.01），12、48 h時(shí)恢復(fù)至正常水平，而在24、72 h時(shí)顯著下降（＜0.05），96 h時(shí)極顯著降低(< 0.01)。在鰓組織中，攻毒后6、12 h時(shí)顯著增加（＜0.05），24 h時(shí)恢復(fù)正常水平，而在48、72、96 h時(shí)顯著降低（＜0.05）。在肌肉組織中，攻毒后12 h和48 h時(shí)極顯著增加（＜0.01）而在24 h時(shí)極顯著降低（＜0.01）。在脾臟中，攻毒后12、24、48和72 h時(shí)顯著增加（＜0.05），96 h恢復(fù)至正常水平。在腸組織中，攻毒后6、48 h時(shí)極顯著增加（＜0.01），72 h時(shí)顯著增加（＜0.05），而在12 h時(shí)極顯著降低（＜0.05），在24、96 h時(shí)恢復(fù)至正常水平。在肝臟中，6、24和48 h時(shí)顯著增加（＜0.05），在72、96 h時(shí)顯著下降（＜0.05），而在12 h時(shí)恢復(fù)至正常水平，而在72、96 h時(shí)顯著降低（＜0.05）。在胸腺中，攻毒后24、48 h時(shí)顯著增加（＜0.05），其他時(shí)間無顯著差異。在外周血中，攻毒后24 h時(shí)極顯著增加（＜0.01），而在6、12、48、72和96 h時(shí)均呈現(xiàn)顯著降低（＜0.05）。綜上，攻毒后在頭腎、皮膚、鰓、脾臟、胸腺組織中總體上呈先升后降變化，而在腦、肌肉、腸、肝臟、外周血中變化規(guī)律不明顯，其在所有組織中的表達(dá)量均在不同時(shí)間升至最大值。

*，與0 h（對(duì)照）比較P < 0.05；**，與0 h（對(duì)照）比較P < 0.01；On-sialoadhesin在各個(gè)對(duì)照中的表達(dá)量均設(shè)為1

3 討論

本研究成功克隆基因，獲得1 617 bp的ORF序列，編碼538個(gè)氨基酸殘基。在推導(dǎo)的序列中發(fā)現(xiàn)3個(gè)IG結(jié)構(gòu)域和一個(gè)IGC2結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在其他動(dòng)物該蛋白中也存在[15-16]。免疫球蛋白（IG）是機(jī)體受抗原刺激后，由淋巴細(xì)胞特別是漿細(xì)胞合成的一類有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相似的球蛋白[17-19]，主要存在于血液和其他分泌液中，也可作為抗原識(shí)別受體存在于B細(xì)胞膜上。主要功能是特異性結(jié)合抗原、活化補(bǔ)體、結(jié)合Fc受體、調(diào)理吞噬作用、發(fā)揮抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用[20-22]。序列相似性和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析中與奈里樸麗魚序列相似性高達(dá)92.75%，其他不同物種的同源性差，但其中許多功能位點(diǎn)較為保守，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，與慈鯛科魚的聚為1支，親緣性關(guān)系相對(duì)較近（圖6）。可見，本研究所得序列是Siglecs家族的一員。

唾液酸黏附素在豬免疫器官攻毒實(shí)驗(yàn)顯示，在心臟、肝臟、脾臟、腎臟、下頜淋巴結(jié)和腸系膜等中7 d達(dá)最高值，心臟非免疫組織表達(dá)量最低。在人類Siglec-1冠心病患者外周血Siglec-1 (CD169) 的基因表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)組均顯著高于健康對(duì)照組，表明不同物種唾液酸黏附素基因在免疫組織上的表達(dá)仍有相似性[23-24]。本研究中，在健康尼羅羅非魚各組織中均有表達(dá)，但不同組織間表達(dá)量差異較大，其中在頭腎和外周血中表達(dá)量最高，其次是腸、肝臟、脾臟、皮膚、鰓、肌肉、胸腺，在腦中表達(dá)量最低。免疫細(xì)胞是魚類進(jìn)行免疫應(yīng)答的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[26]，羅非魚頭腎含有單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞[25]，是羅非魚重要免疫器官之一，外周血也含有淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞；在羅非魚免疫器官或組織中的高表達(dá)可表明其在羅非魚免疫方面的有重要功能。無乳鏈球菌是羅非魚的重要致病菌，目前，魚類唾液酸黏附素應(yīng)無乳鏈球菌刺激的時(shí)序表達(dá)研究相對(duì)較少。本研究通過腹腔注射無乳鏈球菌誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在頭腎、皮膚、鰓、脾臟、胸腺組織中總體上呈先升后降變化，而在腦、肌肉、腸、肝臟、外周血中變化規(guī)律不明顯，在所有組織中表達(dá)量均在感染后不同時(shí)間升至最大值。由此推測(cè)，可能參與了羅非魚抗菌的感染免疫，在羅非魚體抵抗無乳鏈球菌感染過程中發(fā)揮了重要作用。該基因在各組織中達(dá)到最高表達(dá)量的時(shí)間上有較大差別?？赡芘c無乳鏈球菌刺激時(shí)免疫系統(tǒng)發(fā)揮時(shí)間的長(zhǎng)短和作用機(jī)理有關(guān)。具體原因還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究成功克隆基因ORF序列，通過結(jié)構(gòu)域分析、序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，所得基因是Siglecs家族中的一員。在健康羅非魚各組織中均有表達(dá)，經(jīng)無乳鏈球菌攻毒后，在脾臟、腸、頭腎、肝臟、腦、皮膚、肌肉、胸腺、外周血和鰓等10個(gè)組織中表達(dá)量均有顯著性變化，推測(cè)可能參與羅非魚抗菌感染免疫。

[1] 王斌. 中國(guó)羅非魚出口貿(mào)易國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力研究[D]. 無錫：江南大學(xué), 2011.

[2] 陳賀, 吳灶和, 王蓓, 等. 無乳鏈球菌滅活疫苗對(duì)羅非魚的免疫效果[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 32(6): 50-56.

[3] 柯劍, 趙飛, 羅理, 等. 廣東省羅非魚主養(yǎng)區(qū)無乳鏈球菌的分離、鑒定與致病性[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 30(3): 22-27.

[4] 鄭琦, 陳一錦, 黃瑜, 等. 尼羅羅非魚非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞(NCC)分離條件的優(yōu)化[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 37(3): 123-126.

[5] 雷燕, 肖洋, 趙振峰, 等. 羅非魚羅湖病毒RT-PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 39(3): 1-5.

[6]吳鳳雷, 黃瑜, 黃郁蔥, 等. 羅湖病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2019, 39(5): 31-37.

[7] CROCKER P R, MUCKLOW S, BOUCKSON V, et al. Sialoadhesin, a macrophage sialic acid binding receptor for haemopoietic cells with 17 immunoglobulin-like domains[J]. The EMBO Journal, 1994, 13(19): 4490-4503.

[8] JONES C, VIRJI M, CROCKER P R. Recognition of sialylated meningococcal lipopolysaccharide by siglecs expressed on myeloid cells leads to enhanced bacterial uptake[J]. Molecular Microbiology, 2003, 49(5): 1213-1225.

[9] CROCKER P R, PAULSON J C, VARKI A. Siglecs and their roles in the immune system[J]. Nature Reviews. Immunology, 2007, 7(4): 255-266.

[10] 黃瑜. 羅非魚NCC活性調(diào)控蛋白及效應(yīng)因子的鑒定與功能分析[D]. 湛江: 廣東海洋大學(xué), 2018.

[11] 樊博琳, 黎源, 汪志文, 等. 尼羅羅非魚基因克隆及其組織表達(dá)分析[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2018, 38(6): 6-12.

[12] HUANG Y, ZHENG Q, NIU J Z, et al. NK-lysin from Oreochromis niloticus improves antimicrobial defence against bacterial pathogens[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2018, 72: 259-265.

[13] 張馳宇, 徐順高, 黃新祥. 一種新穎簡(jiǎn)便的熒光實(shí)時(shí)RT-PCR相對(duì)定量方法的建立[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2005, 23(9): 883-888.

[14] 郭宇立, 倪逸聲. 從一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性——Guruprasad, Reedy和Pandit 方法[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 1993(2): 95-99.

[15]ASANO K, KIKUCHI K, TANAKA M. CD169 macrophages regulate immune responses toward particulate materials in the circulating fluid[J]. The Journal of Biochemistry, 2018, 164(2): 77-85.

[16] DE BAERE M I, VAN GORP H, DELPUTTE P L, et al. Interaction of the European genotype porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) with sialoadhesin (CD169/Siglec-1) inhibits alveolar macrophage phagocytosis[J]. Veterinary Research, 2012, 43(1): 1-10.

[17] 龐碧劍. 羅非魚免疫記憶及體外淋巴細(xì)胞增殖的研究[D]. 湛江：廣東海洋大學(xué), 2012.

[18] 黃艷青, 王桂堂, 孫軍, 等. 黃顙魚血清免疫球蛋白的純化及分子量的初步測(cè)定[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2003, 27(6): 654-656.

[19] 馮建軍, 關(guān)瑞章, 林鵬, 等. 魚類免疫球蛋白分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J]. 集美大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2010, 15(6): 420-427.

[20] 黃健, 唐曉霞. 缺氧缺血性腦病新生兒免疫功能的變化及其影響因素[J]. 海南醫(yī)學(xué), 2018, 29(6): 792-793.

[21] 張慶璜. 胭脂魚血清免疫球蛋白單克隆抗體的制備及應(yīng)用研究[D]. 重慶：西南大學(xué), 2014.

[22] MATUCCI A, MAGGI E, VULTAGGIO A. Mechanisms of action of Ig preparations: Immunomodulatory and anti-inflammatory effects[J]. Frontiers in Immunology, 2014, 5: 690.

[23] 熊怡淞, 王皓, 吳煒霖, 等. 定量RT-PCR測(cè)定冠心病患者外周血Siglec-1(CD169)的基因表達(dá)水平[J]. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 29(11): 1307-1310.

[24] 謝周瑞. 豬Siglec-1基因啟動(dòng)子克隆及其在肺泡巨噬細(xì)胞特異性表達(dá)的驗(yàn)證[D]. 南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2012.

[25] 卜梓斌, 姜志勝, 馬珍妮, 等. 氧化高密度脂蛋白通過MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)ECV304細(xì)胞表達(dá)組織因子[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2009, 25(4): 636-641.

[25] 張艷秋, 詹勇, 許梓榮. 魚類免疫機(jī)制及其影響因子[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖, 2005, 26(3): 1-5.

Cloning and Expression Analysis of Sialoadhesin Gene inNile Tilapia ()

NIU Ji-min1, NIU Jin-zhong1,2,3, HUANG Yu1,2,3, JIAN Ji-chang1,2,3, WANG Bei1,2,3, LU Yi-shan1,2,3

（1.// 2.// 3.,524088,）

【Objective】To study the expression ofgene in healthy and sick tilapia () challenged by, and explore the role ofin the immune response of Nile tilapia. 【Method】The open reading frame ofgene (was cloned according to the sequence published on NCBI (GenBank accession number LOC102078335). Real-time quantitative PCR was used to detect the distribution ofin spleen, head kidney, intestine, skin, gill, brain, muscle, liver, thymus, and blood and its expression afterstimulation. 【Result and Conclusion】The coding region ofgene was 1 617 bp, encoding 538 amino acids, with a theoretical molecular mass of 59.44 ku and an isoelectric point of 6.57.contains three IG domains and an IGC2 domain, belongs to the IG domain protein superfamily. Multiple sequence alignments revealed thatshare high sequence homology withof other species ranging from 36.81% to 92.94% and have the highest homology with. Phylogenetic analysis revealed thatandclustered together. Real-time quantitative PCR analysis showed thatwas expressed in all examined tissues of healthy tilapia, with the highest expression in head kidney and peripheral blood. The expression ofin all tissues showed significant time-dependent manner postinfection.

;; gene; clone; expression;

Q78；Q959.483；S941.42

A

1673-9159（2020）04-0021-08

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.04.004

2020-01-30

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31702386）；廣東省科技廳國(guó)際科技合作領(lǐng)域項(xiàng)目（2017A050501037）

牛繼敏（1989—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害防治。E-mail:1018829854@qq.com

簡(jiǎn)紀(jì)常（1964—），男，教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害防治。E-mail: jianjc@ gdou.edu.cn

黃瑜（1986—），男，博士，研究方向?yàn)轸~類免疫學(xué)。E-mail：huangyu@gdou.edu.cn

牛繼敏，牛金中，黃瑜，等. 羅非魚唾液酸黏附素基因克隆及組織表達(dá)[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，40（4）：21-28.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）