梁金榮，許鑾佳，李 玲，郭 慧，申玉春

凡納濱對(duì)蝦克隆與表達(dá)分析

梁金榮，許鑾佳，李 玲，郭 慧，申玉春

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 / 湛江市海洋生態(tài)與養(yǎng)殖環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524025）

【目的】研究凡納濱對(duì)蝦（）miRNA-184 [microRNA-184（miR-184），記作]在健康蝦及染病蝦中的表達(dá)，探討其免疫功能?！痉椒ā坑们o環(huán)法克隆鑒定凡納濱對(duì)蝦，通過熒光定量PCR檢測(cè)在對(duì)蝦血淋巴、肝胰腺、鰓、肌肉、心臟、胃、腸和眼柄等8個(gè)組織中的分布。對(duì)凡納濱對(duì)蝦注射副溶血弧菌（），檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)的響應(yīng)變化。對(duì)感染副溶血弧菌的凡納濱對(duì)蝦分別注射0.3、3.0和30.0 ng的miR-184模擬物和抑制物，檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)蝦血細(xì)胞凋亡率?！窘Y(jié)果與結(jié)論】在所有組織中均有表達(dá)，在胃中表達(dá)量最高，其次是肌肉，鰓表達(dá)量最低。注射副溶血弧菌后1.5 h，表達(dá)量顯著上調(diào)；在24 h達(dá)到峰值，較對(duì)照組高8.25倍；對(duì)照組則維持在較低的水平。模擬物、抑制物注射量為30 ng時(shí)對(duì)蝦血細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）；與對(duì)照組凋亡率相比，注射模擬物6 h后提高62 %。可調(diào)控凡納濱對(duì)蝦的血細(xì)胞凋亡。

凡納濱對(duì)蝦；microRNA；基因克?。换虮磉_(dá)；細(xì)胞凋亡

凡納濱對(duì)蝦 () 具有市場(chǎng)需求量大、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)[1]。但對(duì)蝦規(guī)?；B(yǎng)殖帶來病害頻發(fā)問題，嚴(yán)重制約了對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2]。因此研究對(duì)蝦病害機(jī)制，對(duì)促進(jìn)對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展有重要意義。

miRNA 是一種由17 ~ 25個(gè)核苷酸組成的非編碼RNA[3]，其生物調(diào)控作用廣泛，囊括細(xì)胞的分化、增殖、凋亡等過程[4]；miRNA與信使RNA（mRNA）轉(zhuǎn)錄原理相近，作為一種內(nèi)源RNA，miRNA有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的特性[5]，主要表現(xiàn)為抑制mRNA翻譯或者降解mRNA[6-7]。對(duì)蝦有強(qiáng)大的非特異性免疫系統(tǒng)[8]，血淋巴為主要的免疫器官之一，在病原體入侵時(shí)，血細(xì)胞主要以吞噬、包囊和形成結(jié)節(jié)等方式發(fā)揮免疫作用[9]。血細(xì)胞程序性凋亡是對(duì)蝦保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、對(duì)抗病菌入侵的方式之一[10]。有研究表明，日本囊對(duì)蝦（）miRNA（）介導(dǎo)誘發(fā)血細(xì)胞凋亡在對(duì)蝦對(duì)抗WSSV感染中起作用[11]，斑節(jié)對(duì)蝦（）感染W(wǎng)SSV后，miR-184（）也發(fā)生明顯變化[11]，推測(cè)miR-184可能與白斑綜合征感染有關(guān)。關(guān)于miR-184在對(duì)蝦中的功能需進(jìn)一步研究。筆者克隆凡納濱對(duì)蝦（記作），通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究組織表達(dá)特征和應(yīng)答副溶血弧菌（）的表達(dá)模式，探究在對(duì)蝦血細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用，為對(duì)蝦抗病免疫機(jī)制探索及其病害防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)菌原液

凡納濱對(duì)蝦體質(zhì)量（12.0 ± 0.5）g，取自湛江市東海島養(yǎng)殖基地。在規(guī)格為0.5 m× 0.8 m × 0.5 m的水族箱中暫養(yǎng)7 d，海水鹽度24，水溫26 ~ 29 ℃，保持連續(xù)充氣；每日按照對(duì)蝦體質(zhì)量5%投喂3次，日換水量1/4。副溶血弧菌由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送，于–80℃下超低溫保存。

1.2 總RNA提取及cDNA的合成

采用Trizol 試劑盒（Invitrogen，貨號(hào)15596018，美國）提取總RNA。用10 mg/mL的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA，并用Nanodrop 2000 超微量核酸蛋白測(cè)定儀（Thermo Scientific，美國）檢測(cè)濃度和質(zhì)量。所有 RNA 樣品各取1 μg，按照PrimeScript? RTreagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 試劑盒（TaKaRa, RR047A，日本），根據(jù)龐鑫等[12]改進(jìn)方法，用miR-184 RT（50 μmol/L）取代試劑盒中的RT Primer Mix合成cDNA。

1.3 MicroRNA-184測(cè)序及鑒定

根據(jù)凡納濱對(duì)蝦miRNA文庫[13]獲取miR-184成熟體序列，根據(jù)成熟序列運(yùn)用primer 5軟件設(shè)計(jì)引物、miR-184 mimics和miR-184 inhibitors，并送往上海生工生物技術(shù)有限公司合成（表1）。采用2 × PCR master MIX（上海生工）進(jìn)行克隆擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：2 × PCR master MIX 25 μL，miR- F 2 μL，miR-184R 2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 19 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 1.5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃下延伸1 min。取PCR產(chǎn)物2 μL 用聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）確認(rèn)目的片段。將剩余PCR產(chǎn)物送往上海生工生物技術(shù)有限公司用miR-F引物進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物

1.4 凡納濱對(duì)蝦miR-184組織表達(dá)

取健康凡納濱對(duì)蝦9尾，暫養(yǎng)1周后分別取血淋巴、肝胰腺、鰓、肌肉、心臟、胃、腸和眼柄等8個(gè)組織于凍存管中保存，按照每3尾蝦的組織混合成一管，實(shí)驗(yàn)設(shè)定3個(gè)重復(fù)，所取組織于液氮速凍保存?zhèn)溆?；注射器用ACD抗凝劑（檸檬酸0.48 g、檸檬酸鈉1.32 g、葡萄糖1.47 g，用雙蒸水定容至100 mL，過濾滅菌）潤洗后抽出血淋巴，以4 ℃、6 000 r/min條件離心5 min，吸去上清，加入500 μL TRIzol，混勻，于– 80 ℃下保存。RNA提取和cDNA合成根據(jù)1.2進(jìn)行。熒光定量PCR反應(yīng)體系：2× SYBR Green Mix (TOYOBO, Japan) 12.5 μL，miR-F 1 μL，miR-184 R 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 1.5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃下延伸1 min。收集數(shù)據(jù)以進(jìn)行后續(xù)分析。

1.5 感染副溶血弧菌后凡納濱對(duì)蝦miR-184的表達(dá)

在凡納濱對(duì)蝦第4步足基部注射濃度為1× 107、1× 108、1× 109CFU/mL的副溶血弧菌，確定24 h半致死濃度（LC50）為1× 109CFU/mL。同法對(duì)凡納濱對(duì)蝦以LC50攻毒，分別收集0、1.5、3、6、12、24、48、72 h的肝胰腺（72 h時(shí)，因存活蝦數(shù)量已無法滿足取樣所需，無法得到72 h的組織表達(dá)結(jié)果）于液氮速凍，按照1.2方法進(jìn)行總RNA提取和cDNA的合成。

1.6 模擬物和抑制物注射量確定

用焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理過的磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋模擬物和抑制物，設(shè)梯度為0.01、0.10和1.00 ng/μL；實(shí)驗(yàn)分為7組，記為C、m1、m2、m3、i1、i2、i3組，每組蝦9尾，注射量為30 μL。對(duì)C組注射1×PBS；m1、m2、m3組按照設(shè)定梯度注射模擬物；i1、i2、i3組按設(shè)定梯度注射抑制物，注射24 h后收集肝胰腺于液氮速凍，按照1.2方法進(jìn)行總RNA提取和cDNA的合成；PCR體系：2 × PCR master MIX 25 μL，miR- F 2 μL，miR-184 R 2 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 19 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 1.5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃下延伸1 min。取PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)目的片段。

1.7 MiR-184過表達(dá)和抑制表達(dá)對(duì)血細(xì)胞凋亡的影響

對(duì)感染副溶血弧菌的凡納濱對(duì)蝦分別注射模擬物和抑制物30 ng，6 h后，按照卓宏標(biāo)等[14]方法，取蝦9尾，每尾抽取血淋巴200 μL，按體積比1∶1與ACD抗凝劑混合，于冰上保存?zhèn)溆?。通過Annexin V/PI apoptosis kit（聯(lián)科生物，AP101）試劑盒檢測(cè)血細(xì)胞凋亡，按照試劑盒方案進(jìn)行冰上避光染色30 min，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，設(shè)定儀器讀取10 000個(gè)細(xì)胞，每管血淋巴重復(fù)檢測(cè)3次。血細(xì)胞凋亡率計(jì)算：

血細(xì)胞凋亡率（%）=（Annexin V FITC光密度值+ PI光密度值）/ 10 000。

1.8 數(shù)據(jù)處理

熒光定量數(shù)據(jù)通過2-ΔΔCT法[7]計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，所得數(shù)據(jù)采用SPSS18.0進(jìn)行單因素方差分析，并運(yùn)用Duncan法進(jìn)行多重比較，通過Excel作圖。

2 結(jié)果

2.1 LvmiR-184克隆鑒定

PAGE結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物長度約60 bp（圖1），符合預(yù)期長度，電泳條帶單一且明亮清晰。測(cè)序結(jié)果顯示，miR-184成熟體（mature miR-184）序列（5′–TGGACG GAGAACTGATAAGGGT–3′）與本課題組建立的miRNA文庫[13]吻合。

M，DNA maker DL 600；C，空白對(duì)照；U6，U6內(nèi)參；184，miR-184

2.2 凡納濱對(duì)蝦LvmiR-184組織表達(dá)分析

在8個(gè)組織中的表達(dá)情況見圖2。結(jié)果表明，在所有組織中均有表達(dá)，在胃中表達(dá)量最高，其次是肌肉，鰓的表達(dá)量最低。

**，與鰓組織比較< 0.01

圖2 凡納濱對(duì)蝦在不同組織的表達(dá)

Fig. 2 Expression ofin different tissues

2.3 感染副溶血弧菌后凡納濱對(duì)蝦miR-184的響應(yīng)

注射1× 109CFU/mL菌液0、1.5、3、6、12、24、48 h時(shí)表達(dá)結(jié)果見圖3。與各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組相比，注射弧菌1.5 h后，開始上調(diào)（< 0.01），24 h時(shí)達(dá)到峰值，其中1.5 h上調(diào)3.47倍，24 h上調(diào) 8.25倍。

**，與對(duì)照組比較P < 0.01

2.4 模擬物和抑制物注射量確定

由圖4A可見，注射30 ng的模擬物組電泳條帶的亮度明顯高于其他組；由圖4B可見注射30 ng的抑制物組條帶亮度較暗，與i1、i2組、對(duì)照組區(qū)別不明顯；30 ng的注射量可達(dá)到過表達(dá)目的，該注射量可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

M, DL 2000 DNA 分子標(biāo)記；c, 對(duì)照組；m1, 0.3 ng模擬物；m2, 3 ng模擬物；m3, 30 ng模擬物；u6, u6內(nèi)參；i1, 0.3 ng抑制物；i2, 3 ng抑制物；i3, 30 ng抑制物

2.5 LvmiR-184過表達(dá)和抑制表達(dá)對(duì)血細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖5、6所示。結(jié)果表明，過表達(dá)顯著提升血細(xì)胞的凋亡率（< 0.01），注射模擬物后，相對(duì)于對(duì)照組，血細(xì)胞凋亡率提升顯著。注射抑制物后未能顯著降低血細(xì)胞的凋亡率（>0.05）。

**，與對(duì)照組比較P < 0.01

A，注射弧菌；B，注射弧菌+抑制物；C，注射弧菌+模擬物

A, vibrio injection; B, vibrio + inhibitor injection; C, vibrio + mimics injection

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血淋巴凋亡情況

Fig. 6 Flow cytometry for detection of hemocyte apoptosis

3 討論

在哺乳動(dòng)物中，可調(diào)節(jié)干細(xì)胞的增殖與分化、癌癥的發(fā)生、細(xì)胞凋亡等過程[15-16]。Wang等[17]發(fā)現(xiàn)，可被活性氧(reactive oxygen species, ROS) 氧化，氧化后的miR-184與Bcl-xL和Bcl-w錯(cuò)配，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡。劉秀娟[18]發(fā)現(xiàn)，miR-184有調(diào)節(jié)大鼠 () 腎小球系膜細(xì)胞衰老進(jìn)程作用。此外，Xu等[19]研究發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦（）在投喂大黃素后出現(xiàn)明顯的差異表達(dá)，表明可能參與了甲殼動(dòng)物的生長、代謝等過程。本研究克隆鑒定凡納濱對(duì)蝦，在眼柄、肝胰腺和胃等組織中高表達(dá)，表明可能參與對(duì)蝦機(jī)體內(nèi)多種調(diào)控作用。

Yang[20]研究表明，在日本囊對(duì)蝦（）對(duì)抗白斑病毒感染中表達(dá)量變化較大；Ou等[21]研究發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦在受到蟹螺原體（）刺激后表達(dá)量顯著上調(diào)；Xu Peng等[22]發(fā)現(xiàn)，河南華溪蟹（）在應(yīng)對(duì)鎘（Cd）誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)中顯著上調(diào)。上述研究結(jié)果表明，在甲殼動(dòng)物中具有潛在的免疫功能。本研究發(fā)現(xiàn)，用副溶血弧菌攻毒凡納濱對(duì)蝦后，注射后1.5 h時(shí)，表達(dá)顯著上調(diào)，并持續(xù)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，表明具有免疫調(diào)節(jié)功能。

本研究中，以成熟體為模板設(shè)計(jì)合成模擬物和抑制物，設(shè)定注射量為30 ng；通過注射模擬物發(fā)現(xiàn)在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的含量明顯增加，而注射抑制物未能降低在凡納濱對(duì)蝦體內(nèi)的含量表明注射模擬物可產(chǎn)生過表達(dá)作用。注射抑制物抑制表達(dá)作用不明顯，可能原因是合成抑制物未加3′ 端化學(xué)修飾，使得抑制物無法與發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合或者結(jié)合。Hughes等[23]發(fā)現(xiàn)，模擬物在人類眼角膜中形成有效的過表達(dá)濃度為15 ng，與本研究不同，可能是因?yàn)槲锓N間對(duì)microRNA的敏感度不同。在甲殼動(dòng)物中，對(duì)蝦僅有非特異性免疫系統(tǒng)，其免疫功能包括吞噬、包囊等；血淋巴作為對(duì)蝦非特異性免疫器官之一，在對(duì)抗病菌、異物入侵等免疫過程起重要作用[9,24]。吞噬、包囊作用發(fā)生后，細(xì)胞開始程序性凋亡是保持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要的機(jī)制[25-26]。本研究表明，過量表達(dá)可增加血細(xì)胞凋亡率，表明可能參與了凡納濱對(duì)蝦細(xì)胞凋亡途徑；抑制表達(dá)未顯著降低血細(xì)胞凋亡率，結(jié)合結(jié)果2.4發(fā)現(xiàn)注射30 ng的抑制物效果不理想，未能抑制的表達(dá)，導(dǎo)致抑制物注射組血細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組不顯著。

研究結(jié)果為了解對(duì)蝦抗病免疫機(jī)制，進(jìn)而防治對(duì)蝦病害提供參考。

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Molecular Cloning and Expression Analysis of MicroRNA-184 in the White Shrimp ()

LIANG Jin-rong, XU Luan-jia, LI Ling, GUO Hui, SHEN Yu-chun

（,/,524025,）

【Objective】To study the expression of microRNA-184 innamed, and explore its immunologic function.【Method】MicroRNA-184 was cloned and identified by stem-loop method from. The distribution ofin eight tissues and the response changes ofat different times after injected withwas detected by qPCR. The apoptosis ratios of hemocyte ofwhich were infected with, were detected after being injected withmimics and inhibitors of 0.3, 3.0, and 30.0 ng, respectively. 【Result and Conclusion】was expressed in all tissues, with the highest expression in the stomach, followed by the muscle and gill. The expression ofin shrimp infected withwas significantly increased after 1.5 h and reached a peak at 24 h, which was 8.25 times higher than the control; while the control. The results indicated that when the injected amount was 30 ng; it was significantly difference (< 0.05) in the apoptosis rate of shrimp hemocyte, after injection of the mimics or inhibitor. Compared with the control group, the apoptosis rate has increased by 62% at 6 h after injection of the mimics. The results indicate thatcan regulate hemocyte apoptosis in.

; microRNA; gene cloning; gene expression; hemocyte apoptosis

Q78；Q959.223+.63

A

1673-9159（2020）04-0015-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.04.003

2020-02-20

國家自然科學(xué)基金(31600321）

梁金榮（1992－），男，碩士研究生，研究方向?yàn)轲B(yǎng)殖環(huán)境保護(hù)。E-mail: 981061344@qq.com

申玉春（1964－），男，博士，教授，研究方向?yàn)楹Ｑ蟓h(huán)境與生物資源保護(hù)。E-mail: shenyuchun@163.com

梁金榮，許鑾佳，李玲，等. 凡納濱對(duì)蝦克隆與表達(dá)分析[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2020，40（4）：15-20.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）