羅燕，肖靜，吳榮珍

（江西省婦幼保健院生殖健康科，南昌 330006）

子宮內(nèi)膜息肉(endometrial polyps，Emps)是婦科常見(jiàn)多發(fā)疾病，但其發(fā)病機(jī)理不清，但多數(shù)研究認(rèn)為雌孕激素作用失衡在子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用，故常規(guī)子宮內(nèi)膜息肉手術(shù)治療后給予激素治療 （比如后半周期口服孕激素或者短效復(fù)方避孕藥或曼月樂(lè)治療），但仍存在治療失敗復(fù)發(fā)者，考慮此類患者可能存在子宮內(nèi)膜對(duì)孕激素低反應(yīng)甚至無(wú)反應(yīng)，即“孕酮抵抗”。孕酮抵抗在乳腺癌、子宮內(nèi)膜異位癥及子宮內(nèi)膜癌，PCOS疾病中研究較多。目前國(guó)內(nèi)外研究表明[1-6]，孕酮抵抗可能與基因突變、環(huán)境污染、雌孕酮受體（ER/PR）表達(dá)異常以及PR輔激活子有關(guān)。而子宮內(nèi)膜上孕酮受體主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子是甾體受體輔激活因子-2(SRC-2)，也是目前研究孕酮抵抗機(jī)制的熱點(diǎn)之一。本研究通過(guò)子宮內(nèi)膜息肉上ER、PR的表達(dá)情況，以探討孕酮抵抗的及SRC-2調(diào)控孕激素受體活性的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)選取2017年1月-2019年1月間在江西省婦幼保健醫(yī)院行宮腔鏡下子宮內(nèi)膜息肉電切術(shù)或者美奧舒子宮內(nèi)膜息肉切除術(shù)的子宮內(nèi)膜息肉初發(fā)組45例和子宮內(nèi)膜息肉復(fù)發(fā)組30例和正常對(duì)照組40例，觀察ER、PR和SRC-2在子宮內(nèi)膜息肉初發(fā)組，復(fù)發(fā)組和正常內(nèi)膜組織在腺上皮、間質(zhì)內(nèi)的表達(dá)情況。

研究組納入標(biāo)準(zhǔn)：育齡期婦女，月經(jīng)周期規(guī)律，無(wú)其他內(nèi)科疾病，經(jīng)宮腔鏡及病理活檢確診為子宮內(nèi)膜息肉及增生期內(nèi)膜，按子宮內(nèi)膜息肉根據(jù)病史，分為子宮內(nèi)膜息肉初發(fā)組，子宮內(nèi)膜息肉復(fù)發(fā)組。

對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：育齡期婦女，月經(jīng)周期規(guī)律，無(wú)其他內(nèi)科疾病，非功能性卵巢囊腫或子宮肌瘤為對(duì)照組，年齡與研究組匹配，術(shù)后內(nèi)膜病理檢查排除子宮內(nèi)膜息肉及子宮內(nèi)膜增生疾病，并證實(shí)增生期子宮內(nèi)膜。

1.2 試驗(yàn)材料 兔抗人ER單克隆抗體 （福州邁新生物）；兔抗人PR單克隆抗體(福州邁新生物)；兔抗人SRC-2單克隆抗體(福州邁新生物)，

1.3 方法 免疫組化檢測(cè)ER、PR和SRC-2蛋白：標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，乙醇脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片。采用免疫組化二步法結(jié)合高壓抗原修復(fù)法檢測(cè)ER、PR和SRC-2蛋白表達(dá)，PBS組為陰性對(duì)照。主要步驟如下：⑴將石蠟切片脫蠟、水化；⑵緩沖液修復(fù)抗原；⑶加過(guò)氧化物酶阻斷，室溫下孵育10 min；⑷加一抗，室溫下孵育60min，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照；⑸加二抗，室溫下孵育15min；⑹顯色；⑺復(fù)染；⑻脫水、透明、封片；⑼顯微鏡下判讀。

1.4 免疫組化檢測(cè)結(jié)果判斷 由一位資深的病理科醫(yī)生判讀，切片中特定細(xì)胞上呈棕黃色著色為陽(yáng)性結(jié)果，無(wú)棕黃色著色為陰性結(jié)果。隨機(jī)選擇10個(gè)高倍視野觀察，然后按照半定量得分判讀結(jié)果。半定量得分=∑陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞率。染色強(qiáng)度評(píng)分劃分為：無(wú)著色（0分）；淺黃色（1分）；棕黃色（2 分），棕褐色（3 分）。 陽(yáng)性細(xì)胞率分為：≤10%（1 分）；11%-50%（2 分）；51%-75%（3分）；76%-100%（4分）。最后半定量得分：陽(yáng)性細(xì)胞率與著色強(qiáng)度的乘積（0-12分），分4個(gè)級(jí)別：0-2分（陰性—）；3-5 分（弱陽(yáng)性+）；6-8 分（陽(yáng)性++）；9-12分（強(qiáng)陽(yáng)性+++）。其中積分大于等于3分則判定為陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 17．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用“±s”表示，正態(tài)資料組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組一般資料比較 3組的年齡之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，初發(fā)組(36±2.65)歲，復(fù)發(fā)組(34.88±9.95)歲，對(duì)照組(35±2.83)歲；3組的兩兩之間產(chǎn)次差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，初發(fā)組(3.2±1.6)次，復(fù)發(fā)組(1.06±1.12)次，對(duì)照組(1.75±0.96)次。

2.2 ER在3組中的表達(dá) 腺上皮染色表達(dá)強(qiáng)于間質(zhì)，初發(fā)組和復(fù)發(fā)組染色分級(jí)強(qiáng)度高于對(duì)照組，對(duì)照組腺上皮和間質(zhì)的染色強(qiáng)度較均勻。采用K-W檢驗(yàn)，χ2=8.408，P=0.15，3 組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見(jiàn)表 1）。

2.3 PR表達(dá)在3組中表達(dá) 經(jīng)K-W檢驗(yàn)，χ2=30.452，P=0.00，3組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，根據(jù)平均秩次可推斷：復(fù)發(fā)組PR陽(yáng)性表達(dá)率最低，其次初發(fā)組，再者對(duì)照組（見(jiàn)表1）。

2.4 SRC-2表達(dá) 3組之間K-W檢驗(yàn)，χ2=20.853，P=0.00，3組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，根據(jù)平均秩次可推斷：復(fù)發(fā)組SRC-2陽(yáng)性表達(dá)率最低，其次初發(fā)組，再者對(duì)照組（見(jiàn)表1）。

2.5 ER、PR表達(dá)與SRC-2表達(dá)的相關(guān)性 ER表達(dá)與SRC-2表達(dá)的偏相關(guān)系數(shù)=0.508（P=0.743），相關(guān)關(guān)系不顯著。

PR表達(dá)與SRC-2表達(dá)的偏相關(guān)系數(shù)=0.7929（P=0.00），相關(guān)關(guān)系密切，兩者的簡(jiǎn)單相關(guān)系數(shù)=0.8107（P=0.00）。

2.6 子宮內(nèi)膜息肉復(fù)發(fā)組ER、PR表達(dá)與SRC-2表達(dá)免疫組化圖片

表1 ER、PR、SRC-2蛋白在3組組織中的表達(dá)情況

3 討論

子宮內(nèi)膜息肉是子宮異常出血的常見(jiàn)原因，其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚，且復(fù)發(fā)者對(duì)孕激素治療低反應(yīng)甚至無(wú)反應(yīng)，其機(jī)制也不清楚。故本研究從子宮內(nèi)膜息肉激素受體及輔激活子水平進(jìn)行相關(guān)探討。

3.1 正常子宮內(nèi)膜PR、ER表達(dá) 正常子宮內(nèi)膜在性激素周期的調(diào)控下發(fā)生周期性變化，所以子宮內(nèi)膜上PR、ER的表達(dá)也是呈周期性變化。增生期子宮腺上皮及間質(zhì)PR、ER表達(dá)豐富，尤其ER表達(dá)最高；排卵后，ER、PR表達(dá)顯著下降，排卵期PR表達(dá)高峰，之后腺上皮表達(dá)下降，間質(zhì)表達(dá)相對(duì)增加[7]。

3.2 子宮內(nèi)膜息肉初發(fā)組PR、ER表達(dá) 目前國(guó)內(nèi)外各學(xué)者子宮內(nèi)膜息肉的發(fā)生與ER、PR異常表或者ER/PR比例失調(diào)有關(guān)，但具體結(jié)論各異。Khush Mittal等[8]研究者發(fā)現(xiàn)與正常子宮內(nèi)膜相比，子宮內(nèi)膜息肉的基質(zhì)細(xì)胞ER、PR表達(dá)減少，但是腺上皮中ER、PR的表達(dá)無(wú)顯著差異。Lopes RG等[9]學(xué)者發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜息肉ER和PR的濃度均明顯高于正常子宮內(nèi)膜組，在息肉和子宮內(nèi)膜間質(zhì)中ER和PR的濃度相似。Taylor LJ等[2]研究發(fā)現(xiàn)增生期子宮內(nèi)膜息肉顯示孕酮受體的弱或不表達(dá)，分泌期息肉顯示雌激素受體的高表達(dá)。潘萍等[10]國(guó)內(nèi)學(xué)者提示ER和PR在子宮內(nèi)膜息肉和增殖期子宮內(nèi)膜中的表達(dá)無(wú)差異。佘遠(yuǎn)萍等[11]研究提示ER在息肉組的表達(dá)高于內(nèi)膜組，PR在息肉組的表達(dá)低于內(nèi)膜組。夏恩蘭等[12]研究發(fā)現(xiàn)ER在息肉組及內(nèi)膜組中腺體及間質(zhì)上的表達(dá)均無(wú)差異，PR在息肉組中腺體及間質(zhì)上的表達(dá)均低于內(nèi)膜組。而本組研究資料提示，增生期ER在息肉初發(fā)組以及正常內(nèi)膜組中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，增生期PR表達(dá)在息肉初發(fā)組的表達(dá)低于正常內(nèi)膜組。與夏恩蘭等研究結(jié)果一致。故考慮增殖期子子宮內(nèi)膜息肉PR表達(dá)低與子宮內(nèi)膜息肉的形成可能有關(guān)。

3.3 子宮內(nèi)膜息肉復(fù)發(fā)組PR、ER表達(dá) 對(duì)于復(fù)發(fā)組子宮內(nèi)膜息肉，本研究資料提示相對(duì)正常子宮內(nèi)膜，增生期復(fù)發(fā)組和初發(fā)組一樣也是ER高表達(dá)低PR表達(dá)，但是ER的表達(dá)在3組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且復(fù)發(fā)組和初發(fā)組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果和饒蕓等[13]學(xué)者研究結(jié)果僅PR表達(dá)方面一致，其研究提示與正常內(nèi)膜組相比，初發(fā)、復(fù)發(fā)組ER-α表達(dá)更高，PR表達(dá)更低，但是復(fù)發(fā)組與初發(fā)組ER-α、PR的表達(dá)無(wú)顯著性差異，而且復(fù)發(fā)EP周圍內(nèi)膜、初發(fā)EP周圍內(nèi)膜與正常內(nèi)膜相比，ER-α、PR的表達(dá)無(wú)差別。

3.4 SRC在各組的表達(dá)意義 本研究中發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜息肉初發(fā)組及復(fù)發(fā)組存在PR/ER比例失調(diào)，相對(duì)對(duì)照組而言，兩組中ER腺上皮陽(yáng)性率高，而PR陰性率高，甚至缺失，部分證實(shí)了“孕酮抵抗”現(xiàn)象和原因。孕酮抵抗在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜異位癥及子宮內(nèi)膜癌，PCOS疾病中研究較多。目前國(guó)內(nèi)外研究表明[1-6]，孕酮抵抗可能與基因突變、環(huán)境污染、雌孕酮受體（ER/PR）表達(dá)異常以及PR輔激活子有關(guān)。本研究和其他國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究均提示子宮內(nèi)膜息肉上PR低表達(dá)，甚至陰性表達(dá)。而子宮內(nèi)膜上PR屬于核受體家族，PR與孕激素結(jié)合，需要募集輔激活子來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用[14，20]。其中輔激活子包括甾體激素受體輔激活子（steroid receptor coactivator，SRC）家族，過(guò)氧化氫誘導(dǎo)克隆5（hydrogenperoxide-inducible clone-5，Hic-5）FK506 結(jié)合蛋白 4（FK506 binding protein 4，F(xiàn)KBP4）[15，21]。 其中 SRCs 是最早被發(fā)現(xiàn)的核受體輔激活子，其家族成員包括SRC-1、SRC-2和SRC-3。Johnson AB等研究發(fā)現(xiàn)SRC-1-2-3結(jié)構(gòu)相似，但在組織分布和功能上存在一定的區(qū)別[16]。其中子宮PR的優(yōu)勢(shì)輔激活子SRC-2在子宮內(nèi)膜上的表達(dá)與PR表達(dá)具有時(shí)間和空間的一致性[17]。 González-Arenas 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，SRC-2 表達(dá)缺失不影響ER介導(dǎo)的子宮內(nèi)膜增殖反應(yīng)，卻抑制PR介導(dǎo)的子宮內(nèi)膜蛻膜樣變化。PR正常的SRC-2基因敲除小鼠具有嚴(yán)重的胚胎種植和生育功能缺陷[19]。以上研究表明，SRC-2是子宮PR的優(yōu)勢(shì)輔激活子，SRC-2表達(dá)下降會(huì)顯著削減子宮PR對(duì)孕激素的反應(yīng)性。本研究也顯示，初發(fā)組及復(fù)發(fā)組的PR和SRC-2蛋白表達(dá)低，且陰性表達(dá)高，而對(duì)照組內(nèi)膜的PR和SRC-2蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高，而且3組蛋白表達(dá)分級(jí)也不同，初發(fā)組及復(fù)發(fā)組的PR、SRC-2蛋白表達(dá)均低于對(duì)照組，尤其復(fù)發(fā)組明顯，且整體標(biāo)本中PR蛋白表達(dá)與SRC-2表達(dá)相關(guān)關(guān)系密切。以上研究表明子宮內(nèi)膜息肉存在孕酮抵抗現(xiàn)象，且存在PR蛋白的表達(dá)低下，而SRC-2是子宮PR的優(yōu)勢(shì)輔激活子，SRC-2蛋白的表達(dá)下降，降低了子宮PR對(duì)孕酮的反應(yīng)性。這可能就是子宮內(nèi)膜息肉初發(fā)者及復(fù)發(fā)者出現(xiàn)孕酮抵抗現(xiàn)象的分子機(jī)制之一。