孟繁榮 楊瑜 雷杰 王楠 李華 謝貝 鄧麗 牛群 竺澎波 高俊文 劉志輝

廣東省廣州市胸科醫(yī)院肺部疾病研究所，呼吸疾病國家重點實驗室結(jié)核病實驗室（廣州510095）

氟喹諾酮類（fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）藥物因其具有穩(wěn)定高效的抗結(jié)核作用被世界衛(wèi)生組織推薦為耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）化學(xué)治療的A 類藥物［1］，也是我國MDRTB 治療方案中的首選用藥［2］，然而隨著其廣泛應(yīng)用，結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，Mtb）對氟喹諾酮類藥物的耐受也日益引起人們關(guān)注。目前人們將快速藥敏試驗的方法聚焦于分子生物學(xué)檢測技術(shù)。研究［3］表明，結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮藥物的耐受主要緣于該類藥物作用靶位DNA解旋酶的編碼基因gyr 突變。世界衛(wèi)生組織于2016年推薦將分子線性探針技術(shù)直接應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮類藥物的耐藥性診斷［4］，已在世界各地得到廣泛應(yīng)用。然而，由于結(jié)核分枝桿菌的遺傳背景［5］和環(huán)境因素的不同影響，目前關(guān)于氟喹諾酮藥物耐藥基因突變位點和突變類型及頻率的報道在各個國家和地區(qū)差異較大［6-8］。為充分評估現(xiàn)有二代線性探針技術(shù)對我國結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥性診斷的適用性，本研究對我國氟喹諾酮耐藥結(jié)核分枝桿菌的gyr 基因序列進行了循證分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 檢索策略以檢索式“quinolones resistance AND Mycobacterium tuberculosis AND（China OR Hong Kong OR Tai Wan OR Macon）”和“喹諾酮耐藥AND 結(jié)核”分別在英文數(shù)據(jù)庫（pubmed、Embase、SciFinder）和中文數(shù)據(jù)庫（萬方、中國知網(wǎng)、中國生物醫(yī)學(xué)文獻服務(wù)系統(tǒng)與維普期刊資源服務(wù)平臺）中檢索截至2020年2月15日有關(guān)我國結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮類耐藥基因突變的研究文獻。

1.2 文獻納入與排除標準納入標準：（1）所研究的結(jié)核分枝桿菌菌株均來自中國（包括香港、澳門和臺灣地區(qū)）；（2）氟喹諾酮類藥物耐藥表型采用比例法或絕對濃度法測定；（3）氟喹諾酮耐藥基因gyrA、gyrB 基因序列均采用DNA 測序方法獲得；（4）報告需包括基因突變的位點，堿基或氨基酸變化信息，并且明確將雙位點、多位點突變作為突變類型單獨統(tǒng)計。排除標準：（1）以作者單位、文獻出版時間、菌株數(shù)量及來源等信息排除重復(fù)報道的文獻；（2）綜述性文獻；（3）中文和英文以外語種的文獻。

1.3 文獻篩選與數(shù)據(jù)提取通過瀏覽文題和摘要對文獻進行初篩，對獲得全文的文獻由2 名專業(yè)人員嚴格按照納入和排除標準獨立進行數(shù)據(jù)提取和整理分析并交叉核對，內(nèi)容包括：第一作者姓名、研究機構(gòu)、Pubmed 標識碼PMID、文獻發(fā)表年度、菌株來源、菌株數(shù)量、突變位點、堿基或氨基酸變化、突變株數(shù)量等，數(shù)據(jù)提取和整理分析過程中出現(xiàn)的分歧則由第3 名研究者進行審定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用Excel 2019 對納入研究的文獻中氟喹諾酮類耐藥基因的突變信息進行錄入合并，采用SPSS 19.0 進行統(tǒng)計學(xué)分析。應(yīng)用頻數(shù)、百分比指標進行計數(shù)資料的描述性分析；對結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥MDR 株與除氟喹諾酮外其它藥物耐藥情況不清晰的菌株，二者間的gyrA、gyrB 基因突變情況，應(yīng)用行×列表資料的χ2檢驗進行多個樣本率的比較，以P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 文獻檢索基本情況檢索到文獻共393 篇，后通過閱讀文題和摘要初步剔除，得到60 篇外文和42 篇中文文獻全文。通過閱讀文獻全文，嚴格執(zhí)行納入與剔除研究標準，最終32 篇外文和23 篇中文文獻納入研究。研究對象包括我國大陸地區(qū)福建、廣東、四川、貴州、甘肅、西藏、河北、山東、浙江、湖南、黑龍江等26 個省、直轄市和我國香港、臺灣地區(qū)從1996 至2020年以來的菌株。納入文獻的基本情況見表1。

2.2 3 641 株氟喹諾酮耐藥結(jié)核分枝桿菌株gyrA基因序列分析結(jié)果55 個研究共對3 641 株結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥株進行了gyrA 基因序列檢測。2 830（77.73%）株氟喹諾酮耐藥株存在gyrA基因突變，共47 種突變類型，無堿基缺失與插入突變，單位點和雙位點突變的發(fā)生率分別為75.83%（2 760/3 641）和1.92%（70/3 641）。在基因突變類型中，94、90、91 位氨基酸位點突變較為常見，突變率分別為49.33%（1 796/3 641）、19.14%（697/3 641）、5.80%（211/3 641），其中，以出現(xiàn)頻率由高到低計，前6 位突變類型分別是Asp94Gly、Ala90Val、Asp94Ala、Asp94Asn、Ser91Pro、Asp94Tyr。見表2。

表1 納入文獻基本情況Tab.1 Basic information of included documents

表2 3 641 株氟喹諾酮類耐藥中國結(jié)核分枝桿菌株gyrA基因突變情況Tab.2 Distribution of mutations in gyrA in 3 641 FQ-resistant strains

2.3 1 958 株氟喹諾酮耐藥結(jié)核分枝桿菌株gyrB基因序列分析結(jié)果55 個研究中有29 項研究同時檢測了氟喹諾酮耐藥株gyrA 與gyrB 基因序列，共計1 958 株。175（8.94%）株氟喹諾酮耐藥株發(fā)生了gyrB 基因突變，其中56 株的29 個突變類型包括500、424、543、485、540、551、447、461、498、504、511、512、538、508、539、98、425、434、486、517單位點與419/465、539/551 雙位點為gyrB 單基因突變，占gyrB 序列突變的32%（56/175），總的突變率為2.86%；其余119 株的36 種突變類型則與gyrA基因突變共同發(fā)生，占gyrB 序列突變的68%（119/175），總的突變率為6.08%。見表3。

表3 1 958 株氟喹諾酮類耐藥中國結(jié)核分枝桿菌gyrA、gyrB 基因突變情況Tab.3 Distribution of mutations in gyrA and gyrB in 1 958 FQ-resistant strains

2.4 結(jié)核分枝桿菌gyr 基因突變率在FQ 耐藥MDR 株與除FQ 外其他藥物耐藥背景不清晰菌株間的差異在1 958株同時檢測了gyrA與gyrB基因序列的結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥菌株中，614 株為同時對利福平和異煙肼耐藥MDR 株，對gyrA、gyrB 基因突變率在MDR 株與其它藥物耐藥背景不清晰菌株中的差異性進行了χ2檢驗，χ2值分別為0.715 和0.623，P值分別為0.398 和0.430，二者差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

表4 gyrA、gyrB 基因突變率在FQ 耐藥MDR 株與除FQ 外其它藥物耐藥背景不明菌株中的差異性比較>Tab.4 Comparison of the mutation rates of gyrA and gyrB between MDR strains of FQ resistant and those with unknown information of drug resistance except FQ

3 討論

氟喹諾酮作用于結(jié)核分枝桿菌的唯一靶標是DNA 解旋酶，通過抑制DNA 解旋酶活性，干擾DNA 復(fù)制而導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌死亡。DNA 解旋酶由2 個A 亞基和2 個B 亞基組成，分別由gyrA、gyrB基因編碼，結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮產(chǎn)生耐藥的主要機制便是gyrA、gyrB 基因序列發(fā)生突變。

已有研究證實，在gyrA 基因中，Glu21Gln、Thr80Ala、Ser95Thr、Gly247Ser 和Gly668D 位密碼子突變是結(jié)核分枝桿菌gyrA 基因的天然多態(tài)性或遺傳譜系標志物［7，9-11］，與氟喹諾酮的耐藥性無關(guān)。納入本循證分析的研究報道中，一項研究提及Glu21Gln 密碼子突變，多項研究提及Ser95Thr 密碼子突變，但均已言明該突變類型為gyrA 基因的遺傳多態(tài)性表現(xiàn)，因此，文獻中出現(xiàn)的這兩個單位點突變，筆者將其歸類為“無突變”，不計入gyrA 基因突變位點和類型的分析。本文所納入的研究包括3 641 株氟喹諾酮耐藥結(jié)核分枝桿菌，均對gyrA基因進行了測序，其中1 958 株也同時檢測了gyrB基因序列。本研究通過綜合分析發(fā)現(xiàn)，我國結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥株檢測到47 個gyrA 基因突變位點和類型，大部分發(fā)生在94、90 和91 位密碼子，突變發(fā)生的頻率由高到低依次為Asp94Gly、Ala90Val、Asp94Ala、Asp94Asn、Ser91Pro、Asp94Tyr，與其它兩個結(jié)核病高負擔國家印度和俄羅斯略有差異［12-16］。我國結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥株gyrA 基因總突變率為77.73%，與河北、四川、福建、重慶、天津等個別省市和地區(qū)［17-21］的差別較大，一方面是因為樣本量的大小有差異，另一方面也進一步說明gyrA基因序列特征具有地域性差異，然而本文所分析的結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥菌株包括中國大陸地區(qū)東、西、南、北、中大部分省份和各直轄市以及香港和臺灣地區(qū)，且研究機構(gòu)均為國內(nèi)具有資質(zhì)的高水平專業(yè)機構(gòu)，本文的分析相當于多中心的研究，當能代表我國氟喹諾酮耐藥結(jié)核分枝桿菌gyrA基因突變的整體特征。與gyrA基因突變不同，結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥株gyrB 基因突變涉及的位點廣泛而分散，發(fā)生率較低，為8.94%，且常與gyrA 基因的突變伴隨發(fā)生，單基因突變發(fā)生率為2.86%。從利用分子生物學(xué)技術(shù)快速診斷耐藥結(jié)核的角度來看，目前世界衛(wèi)生組織推薦［22］的第二代線性探針技術(shù)可以檢測gyrA 基因的Ala90Val、Ser91Pro、Asp94Ala、Asp94Asn、Asp94Tyr、Asp94Gly、Asp94His和gyrB 基因的Asn499Asp、Glu501Val 密碼子突變，根據(jù)本文的分析研究，包含上述檢測位點的第二代線性探針技術(shù)可以檢測到我國74.36% 的氟喹諾酮耐藥結(jié)核，尚有5.57%發(fā)生gyr 基因突變的氟喹諾酮耐藥結(jié)核不能被二代線性探針技術(shù)檢測（我國氟喹諾酮耐藥結(jié)核分枝桿菌gyr 基因突變發(fā)生率為79.93%，1 565/1 958）。因此也應(yīng)充分考慮除高發(fā)位點之外的其它突變位點和類型在我國耐藥結(jié)核分子檢測中的價值。

同時，納入文獻中的部分結(jié)核分枝桿菌氟喹諾酮耐藥株明確標明同時也是對利福平和異煙肼耐藥的MDR 菌株，那么gyrA、gyrB 基因在FQ 耐藥的MDR 菌株中突變發(fā)生率是否有別于除FQ 外其它藥物耐藥背景不清晰的菌株呢？我們也對此進行了差異性比較分析，發(fā)現(xiàn)無論是gyrA 基因還是gyrB 基因，其突變發(fā)生率在MDR 菌株與其它藥物耐藥背景不清晰的菌株中并差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這也說明其它化療藥物的耐藥背景對結(jié)核分枝桿菌gyr 基因突變發(fā)生率影響不大。

本研究通過循證分析發(fā)現(xiàn)，我國氟喹諾酮耐藥的結(jié)核分枝桿菌中尚有21.07%未發(fā)現(xiàn)gyrA 或gyrB 基因突變，這可能是因為我國現(xiàn)有的研究大多集中在gyrA 與gyrB 基因的耐藥決定區(qū)，而未對耐藥決定區(qū)外的序列進行充分研究，但也提示仍有其它耐藥機制尚待闡明。因此，在現(xiàn)有階段分子生物學(xué)技術(shù)還不能完全取代傳統(tǒng)的藥物敏感試驗來檢測氟喹諾酮類藥物的耐藥性。同時，未來也應(yīng)積極研究探索新的耐藥機制，為更全面、精準、快速的檢測手段的研發(fā)提供足夠的理論依據(jù)。

本文的不足之處在于，沒有對結(jié)核分枝桿菌gyr 基因突變位點、突變類型與氟喹諾酮耐藥水平之間的關(guān)系進行分析，有研究表明gyr 基因突變位點和類型能夠反映結(jié)核分枝桿菌對氟喹諾酮類藥物的低濃度或高濃度耐藥［23-25］，然而針對這方面的研究目前報道并不多，還需進一步研究。