鄢文 郭蕾 郭立兵 靳文

廣東省第二人民醫(yī)院1腫瘤一科，2婦科，3心血管內(nèi)三科（廣州510317）

卵巢癌（ovarian cancer，OC）是婦科常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其致死率居于女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的首位，原因在于OC 起病隱匿，缺乏積極有效的OC 早期篩查及預(yù)防手段，進(jìn)展速度快，大部分OC 患者在初次就診時已處于晚期，治療效果和預(yù)后差［1-3］。上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）是OC 最主要的病理類型［1-3］。目前對EOC 的發(fā)病和浸潤、轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不清楚，是制約EOC 防治的關(guān)鍵因素。

血小板是來源于骨髓成熟巨核細(xì)胞胞漿脫落的小而無核的細(xì)胞質(zhì)碎片，含有microRNA、長鏈非編碼RNA、環(huán)狀RNA（circRNA）、線粒體DNA 等大量生物活性物質(zhì)，介導(dǎo)了生理性止血、凝血功能，廣泛參與了機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)。目前認(rèn)為血小板-卵巢癌細(xì)胞的交互作用可能是促進(jìn)OC浸潤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制［4-6］。一方面，OC 細(xì)胞通過釋放活性分子調(diào)節(jié)血小板的數(shù)量、功能以及生物活性分子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移微環(huán)境的形成；另一方面，活化的血小板與OC 細(xì)胞形成聚集物，有助于促進(jìn)OC 細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移、逃避免疫監(jiān)護(hù)、耐藥［4-6］。然而，血小板-卵巢癌細(xì)胞交互作用的確切分子機(jī)制尚未完全闡明。

microRNAs 是一類與血小板功能、卵巢癌浸潤和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)的一類小分子RNA。miR-19b是miR-17-92 基因簇中重要的致癌成員之一，可能與血小板聚集和活化、卵巢癌增殖和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［7-8］。本研究旨在探討miR-19b 在EOC 患者外周血小板中的表達(dá)，分析其與卵巢癌分期和血小板活化和聚集功能的關(guān)系，為進(jìn)一步明確miR-19b是否參與調(diào)控血小板-卵巢癌細(xì)胞的交互作用提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集2018年6月至2019年10月廣東省第二人民醫(yī)院住院治療的EOC 患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）首次就診的未行藥物和手術(shù)治療的EOC患者；（2）組織病理學(xué)明確診斷為EOC，并根據(jù)2013年修訂的國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）OC 手術(shù)病理分期（FIGO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期）進(jìn)行分組，即FIGOⅠ-Ⅱ期組、FIGO Ⅲ-Ⅳ期組。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡＞80 歲；（2）非EOC 患者；（3）合并血液系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織疾病、動脈粥樣硬化血栓性疾病、糖尿病等以及正在接受抗血小板、抗凝藥物治療的患者；（4）已行化學(xué)藥物治療、放射治療以及手術(shù)治療的患者；（5）拒絕參加本項目研究的患者。本研究項目已經(jīng)廣東省第二人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)后實施。收集所有EOC 患者的臨床資料，包括年齡、血常規(guī)、血清腫瘤標(biāo)記物（CA125）、臨床分期（FIGO 分期）、腫瘤病理分級、是否合并大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移、深靜脈血栓（deep vein thrombosis，DVT）等。見表1。

1.2 血栓彈力圖檢測血小板聚集功能于入院次日清晨以肝素抗凝管采集靜脈血3 mL，采用美國TED-500 血栓彈力圖檢測儀檢測并繪制血栓彈力圖，記錄凝血因子激活時間（R 值）、血塊形成速率參數(shù)（K 值）、彈力圖最大切角（Angle，α 值）、彈力圖最大振幅（MA 值）和凝血綜合指數(shù)（CI 值）。

表1 40 例EOC 患者臨床和病理資料Tab.1 Clinical and pathological data of 40 EOC patients 例

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板CD61 和CD62P（Pselectin）的表達(dá)于患者入院次日晨起時采集靜脈血10 mL 加入裝有1.67 mL 酸性檸檬酸葡萄糖溶液（ACD：120 mmol/L 檸檬酸鈉、110 mmol/L 葡萄糖，80 mmol/L 檸檬酸）的試管中，加入終濃度10 μmol/L 吲哚美辛，室溫下以200 g 離心10 min，分別吸取血漿和富血小板層血漿。血漿存儲于-80 ℃冰箱。于流式陰性對照管加入5 μL 富血小板血漿、CD61-FITC、IgG1-PE，陽性對照管中加入5 μL 富血小板血漿、CD61-FITC、CD62P-PE，孵育20 min 后洗滌，采用流式細(xì)胞儀（Beckman 公司，美國）檢 測CD61 陽 性（CD61+）和CD62P 陽 性（CD62P+）的表達(dá)，部分用于提取血小板RNA。計算CD62P+血小板百分比：CD61+CD62P+血小板數(shù)/CD61+數(shù)×100%。

1.4 DVT 的檢測所有患者無論是否合并存在下肢腫脹、增粗、疼痛等癥狀，均行經(jīng)靜脈超聲檢查、64 排螺旋CT 靜脈血管成像、核磁共振血管成像等檢查以明確診斷是否合并存在DVT。

1.5 實時熒光定量PCR 法檢測血小板miR-19b的表達(dá)加入終濃度為0.1 μg/mL 前列環(huán)素至富血小板血漿（PRP），室溫下以1 000 g 離心10 min，棄去上清液，管底沉淀物為血小板。采用miRNeasyTM Mini Kit 試劑盒提取血小板總RNA，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。實時熒光定量PCR法檢測血小板miR-19b（上游、下游引物序列分別為：5′-UGUGCAAUCCAUGCAAAACUGA-3′、5′-GCTCACTGCAACCTCCTCCTCC-3′）的表達(dá)，U6（上游、下游引物序列分別為：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′、5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′）作為內(nèi)參，具體操作步驟同課題組既往研究［9］。試驗獨(dú)立重復(fù)3 次，采用2-ΔΔCt方法計算miR-19b 的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用Graphpad Prism 8 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對于計量資料以x ± s表示，兩組間樣本比較則采用獨(dú)立樣本t檢驗。對于計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，兩組間計數(shù)資料的比較則采用χ2檢驗。Pearson 相關(guān)性分析評價血小板miR-19b 與血小板計數(shù)、血小板聚集和活化指標(biāo)的關(guān)系。Pearson 相關(guān)性分析評價血小板miR-19b 與DVT 事件的關(guān)系。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FIGOⅠ-Ⅱ期組和FIGO Ⅲ-Ⅳ期組EOC 患者血小板聚集功能和活化比例的分析 血栓彈力圖檢測結(jié)果顯示：與FIGO Ⅰ-Ⅱ期組相比，F(xiàn)IGOⅢ-Ⅳ期的R 值、K 值降低（P＜0.05），MA 值、CI值明顯升高（P≤0.001），Angle 值無明顯變化（P=0.332）。血常規(guī)檢測結(jié)果顯示：與FIGO Ⅰ-Ⅱ期組相比，F(xiàn)IGO Ⅲ-Ⅳ期組血小板計數(shù)明顯升高（P＜0.001）。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：與FIGOⅠ-Ⅱ期組相比，F(xiàn)IGO Ⅲ-Ⅳ期組血小板CD62P 陽性率明顯升高（P ＜0.001）。見表2。

表2 EOC FIGO Ⅰ-Ⅱ期組和FIGO Ⅲ-Ⅳ期組間血小板聚集和活化比例的比較Tab.2 Comparison of platelet aggregation and activation function between EOC FIGO Ⅰ-Ⅱgroup and FIGO Ⅲ-Ⅳgroup ±s

表2 EOC FIGO Ⅰ-Ⅱ期組和FIGO Ⅲ-Ⅳ期組間血小板聚集和活化比例的比較Tab.2 Comparison of platelet aggregation and activation function between EOC FIGO Ⅰ-Ⅱgroup and FIGO Ⅲ-Ⅳgroup ±s

注：FIGO，國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟；R，凝血因子激活時間；K，血塊形成速率參數(shù)；Angle（α 值），彈力圖最大切角；MA，彈力圖最大振幅；CI，凝血綜合指數(shù)

R（min）K Angle（°）MA（mm）CI血小板計數(shù)（×109）CD62P 陽性率（%）FIGO Ⅰ～Ⅱ期（n=10）5.26±1.01 2.07±0.57 65.49±6.58 57.95±5.99 1.06±0.39 232.4±36.16 30.71±13.43 FIGO Ⅲ～Ⅳ期（n=30）4.41±0.99 1.61±0.54 69.27±7.17 67.99±3.51 1.91±0.73 298.3±48.07 49.67±8.72 t 值2.328 2.305 0.983 6.502 3.511 3.964 5.173 P 值0.025 0.027 0.332＜0.001 0.001＜0.001＜0.001

2.2 EOC FIGOⅠ-Ⅱ期組和FIGO Ⅲ-Ⅳ期組的臨床資料和血小板miR-19b 的表達(dá) 臨床資料顯示：患者年齡、病理分級、DVT 事件在FIGO Ⅰ-Ⅱ期組、FIGO Ⅲ-Ⅳ期相比均無明顯差異（P＞0.05）。定量PCR 檢測結(jié)果顯示：與FIGO Ⅰ-Ⅱ期組相比，F(xiàn)IGO Ⅲ-Ⅳ期組血小板miR-19b 表達(dá)明顯升高（P＜0.001）。見表3。

2.3 EOC 患者血小板miR-19b 水平與血小板計數(shù)、聚集功能和活化比例、CA125 以及DVT 事件等的相關(guān)性分析Pearson 相關(guān)性分析顯示：血小板miR-19b 表達(dá)水平分別與MA、CI、血小板計數(shù)、血小板CD62P 陽性率、CA125 呈正相關(guān)（P≤0.001），與K 值呈弱負(fù)相關(guān)（r=-0.336，P= 0.034），與R、Ang 值無明顯相關(guān)（P＞0.05）。Spearman 相關(guān)性分析顯示血小板miR-19b 表達(dá)水平與DVT 事件呈正相關(guān)（r=0.730，P＜0.001）。見表4。

表3 EOC FIGO Ⅰ-Ⅱ期組和FIGO Ⅲ-Ⅳ期組間臨床資料和血小板miR-19b 水平的比較Tab.3 Comparison of clinical data and platelet miR-19b levels between EOC FIGO Ⅰ-Ⅱgroup and FIGO Ⅲ-Ⅳgroup x±s，n

表4 EOC 患者血小板miR-19b 水平與血小板計數(shù)、聚集和活化、CA125、DVT 事件等指標(biāo)的相關(guān)性分析Tab.4 Correlation analysis of the relationship between miR-19b expression and platelet count，aggregation and activation index of platelet，and CA125 in all EOC patients

3 討論

圖1 血栓彈力圖檢測血小板聚集功能Fig.1 Platelet aggregation function was detected by Thrombelastogram

OC 細(xì)胞早發(fā)轉(zhuǎn)移是EOC 治療失敗和死亡的主要原因之一［1-3］。血小板作為腫瘤微環(huán)境中的重要分子，可能在促進(jìn)OC 細(xì)胞早發(fā)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［6，10］。本研究結(jié)果顯示：與FIGO Ⅰ-Ⅱ期組相比，F(xiàn)IGO Ⅲ-Ⅳ期組循環(huán)血小板計數(shù)表達(dá)明顯升高，血栓彈力圖指標(biāo)R 值、K 值降低（P＜0.05），MA值、CI 值升高（P≤0.001），血小板活化比例顯著升高（P＜0.001），提示晚期EOC 患者血小板計數(shù)增多、活化和聚集功能增強(qiáng)（圖1）。臨床和基礎(chǔ)研究明確血小板計數(shù)增加與卵巢癌細(xì)胞分泌IL-6 誘導(dǎo)肝細(xì)胞分泌促血小板生成素刺激骨髓產(chǎn)血小板增加等密切相關(guān)［11］，是OC 患者不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子［12］，與OC 無進(jìn)展和/或總體生存狀況惡化相關(guān)［11］。血小板活化與卵巢癌細(xì)胞分泌血栓素A2和二磷酸腺苷、表達(dá)組織因子活化凝血酶等密切相關(guān)［13］。本研究和國外相關(guān)研究結(jié)果提示循環(huán)血小板計數(shù)增多、活化和聚集功能增強(qiáng)，與EOC 轉(zhuǎn)移和進(jìn)展密切相關(guān)。

多數(shù)研究認(rèn)為活化、聚集的血小板可能通過：（1）包繞循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）形成癌栓，保護(hù)CTCs 免受血流剪切力殺傷，逃避免疫監(jiān)視，促進(jìn)OC 細(xì)胞的血行轉(zhuǎn)移；（2）誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化以促進(jìn)OC 細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和產(chǎn)生化療抵抗；（3）介導(dǎo)OC 細(xì)胞黏附、滯留和跨血管轉(zhuǎn)移［13-14］。最近研究［15］發(fā)現(xiàn)血小板微粒源性miR-939 能夠促使EOC 發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)EOC 的轉(zhuǎn)移。然而，miR-939 在血小板中表達(dá)較低。miR-19b 是癌基因miR-17-92 基因簇成員之一，富表達(dá)于血小板中［16］。已有臨床研究顯示相對于單用阿司匹林抗血小板治療，阿司匹林聯(lián)合雙嘧達(dá)莫或氯吡格雷等雙聯(lián)抗血小板治療48 h 后血小板miR-19b 表達(dá)顯著下調(diào)［8］，提示miR-19b 與雙聯(lián)抗血小板等藥物抑制血小板聚集、活化功能密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示：與FIGOⅠ-Ⅱ期組相比，外周血小板miR-19b 的表達(dá)水平在FIGO Ⅲ-Ⅳ期組顯著升高（P＜0.001），并且與MA、CI、血小板計數(shù)、血小板CD62P 陽性率、CA125等存在顯著正相關(guān)，與K 值呈弱負(fù)相關(guān)，提示miR-19b 與晚期EOC 患者血小板的活化、聚集功能增強(qiáng)相關(guān)。

血小板WD-40重復(fù)域1（WD-40 repeat domain 1，WDR-1）是miR-19b 的潛在靶基因之一，在心血管疾病患者中表達(dá)顯著降低；敲除WDR 基因的巨核細(xì)胞系MEG-01 細(xì)胞株（人類巨核細(xì)胞和血小板體外細(xì)胞模型）的活化和聚集功能顯著增強(qiáng)［17］，提示W(wǎng)DR-1 能夠抑制血小板的粘附和聚集功能。結(jié)合本研究結(jié)果，進(jìn)一步提示miR-19b 參與促進(jìn)了卵巢癌患者血小板的活化和聚集功能。此外，臨床和基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)miR-19b 在EOC 組織和細(xì)胞中表達(dá)升高［18-19］，與EOC 復(fù)發(fā)密切相關(guān)［19］，具有促進(jìn)EOC細(xì)胞增殖和遷移的作用［18］。然而，目前尚不清楚miR-19b 在EOC 細(xì)胞與血小板交互作用中扮演何種角色，有待于進(jìn)一步研究。

血小板的激活和聚集是血栓形成的關(guān)鍵因素。卵巢癌相關(guān)性血栓形成是卵巢癌患者的中位生存時間縮短或總體生存率降低的獨(dú)立危險因素［20］。本研究結(jié)果顯示：DVT 事件與血小板miR-19b 表達(dá)呈顯著正相關(guān)（P＜0.001），提示miR-19b 可能參與介導(dǎo)了晚期EOC 患者血小板的聚集和活化以及DVT 事件；但與FIGO Ⅰ-Ⅱ期組相比，DVT 事件在FIGO Ⅲ-Ⅳ期組未見顯著升高（P＞0.05），原因可能在于本研究樣本量相對較少。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)血小板miR-19b 的表達(dá)水平在晚期EOC 患者顯著升高，并且與血小板數(shù)量增多、活化和聚集功能增強(qiáng)密切相關(guān)，提示miR-19b 可能在血小板參與促進(jìn)EOC 的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究局限在于研究樣本量相對較少，未對miR-19b 調(diào)控血小板功能的具體機(jī)制進(jìn)行探討。在今后研究中，本項目將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、通過基礎(chǔ)實驗證實miR-19b 調(diào)控血小板功能及其在EOC 轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。