王堯 巴宏軍 柳子川 周旻 周啟明

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)二科（廣州510095）；2中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管兒科（廣州510080）；3華中科技大學(xué)協(xié)和深圳醫(yī)院南山腫瘤中心（深圳518052）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)第二常見(jiàn)的惡性腫瘤，全世界每年有38 萬(wàn)新發(fā)病例，其中約15 萬(wàn)人死亡［1-2］。非肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌經(jīng)手術(shù)治療預(yù)后良好，而肌肉浸潤(rùn)性膀胱癌患者極易復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，是膀胱癌相關(guān)死亡的主要原因［3-4］。膀胱癌的發(fā)生與炎癥和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān)，卡介苗、癌癥疫苗及免疫檢查點(diǎn)抑制劑（Immune checkpoint inhibitors，ICIs）等免疫治療在膀胱癌中取得了良好的療效［5-7］，但抗PD-1 抗體治療晚期膀胱癌的單藥有效率僅波動(dòng)在20% ～30%之間［8］。因此結(jié)合免疫相關(guān)因素及病理分型對(duì)膀胱癌患者進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)分層有助于判斷預(yù)后及治療反應(yīng)。隨著基因組技術(shù)和高通量分析的發(fā)展，基因檢測(cè)已成為精準(zhǔn)醫(yī)療的重要組成部分，我們采用免疫基因組學(xué)分析將膀胱癌分為三型，并進(jìn)一步分析各型的免疫特征，旨在通過(guò)本研究為判斷患者的預(yù)后和治療反應(yīng)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)采集本研究從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載了409 例膀胱癌患者腫瘤和正常組織的基因表達(dá)譜及相應(yīng)臨床數(shù)據(jù)。納入研究的患者沒(méi)有特殊的排除標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)腫瘤組織對(duì)應(yīng)一個(gè)患者。資料采集時(shí)間為2019年8月1日。

1.2 聚類分析按照免疫基因組功能定義29 個(gè)免疫標(biāo)志的基因集［9］，通過(guò)ssGSEA 來(lái)量化每個(gè)膀胱癌樣本中基因集的富集水平并排序［10］。采用Elbow 法和Gap 統(tǒng)計(jì)量相結(jié)合的方法，決定聚類的分組數(shù)量并進(jìn)行聚類分析［11］。

1.3 腫瘤成分評(píng)估采用CIBERSORT 分析工具通過(guò)反褶積算法推斷不同樣本中22 種腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞（tumor-infiltrating immune cells，TIICs）的組成比例［12］。使用ESTIMATE（estimation of STromal and immune cells in MAlignant tumors using Expression data）方法評(píng)估各個(gè)樣本的免疫評(píng)分、基質(zhì)細(xì)胞含量及腫瘤純度［13］。

1.4 GO 和KEGG 富集分析利用R 軟件中clusterProfiler 包［14］將獲得的表達(dá)矩陣在高免疫組和低免疫組中進(jìn)行基于基因本體論（GO）及京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）的富集分析，判斷兩組主要的功能類別及信號(hào)通路定位。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過(guò)Kaplan-Meier 曲線分析各個(gè)亞組的生存率，并采用log-rank 法進(jìn)行檢驗(yàn)。所有分析均使用R 軟件（3.5.2 版本）進(jìn)行，所有統(tǒng)計(jì)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05 定義為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 病例特征本研究共納入409 例膀胱癌患者，其中男303 例（74.1%），女106 例（25.9%），平均年齡為68.1 歲（34 ～90 歲）。臨床資料包括年齡、性別、腫瘤分級(jí)、T 分期、淋巴結(jié)受累、轉(zhuǎn)移情況（表1）。

2.2 免疫分型及免疫評(píng)分采用ssGSEA 分析29個(gè)免疫相關(guān)基因集［9］來(lái)量化膀胱癌樣本中免疫細(xì)胞、功能或相關(guān)通路的活性及富集水平并進(jìn)行評(píng)分［9］，通過(guò)評(píng)分進(jìn)行聚類分析并將患者分為高、中、低免疫組。3 組間生存率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P= 0.004），高免疫組的生存率明顯預(yù)后優(yōu)于其他兩組（圖1）。ESTIMATE 分析發(fā)現(xiàn)從低免疫組到高免疫組，免疫評(píng)分及基質(zhì)評(píng)分逐漸增加，而腫瘤純度逐漸降低，3 組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）（圖2）。

表1 409 例膀胱癌患者的臨床病理特征Tab.1 Baseline characteristics of 409 patients with bladder cancer

2.3 免疫分型與HLA及單基因的相關(guān)性從低免疫組到高免疫組，大部分HLA基因的表達(dá)水平逐漸升高，各組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3A）。單基因分析發(fā)現(xiàn)從低免疫組到高免疫組，PD-L1、CTLA-4 表達(dá)逐漸升高（圖3B）。

2.4 免疫分型中TIICs 分布及基因富集分析通過(guò)CIBERSORT 分析發(fā)現(xiàn)有8 種TIICs 在各組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，從低免疫組到高免疫組CD8+ T 細(xì)胞逐漸增多，而M0 巨噬細(xì)胞和未活化的記憶性CD4+T 細(xì)胞逐漸減少（圖4）。GSEA 分析發(fā)現(xiàn)高免疫組中顯著上調(diào)的GO 集合及KEGG 信號(hào)通路主要富集在免疫相關(guān)功能方面（表2）。

圖1 膀胱癌各免疫分型的生存曲線Fig.1 Survival curves of different immune groups of bladder cancer（log-rank test）

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程與宿主的免疫系統(tǒng)密切相關(guān)，免疫系統(tǒng)具有識(shí)別和消滅腫瘤細(xì)胞的功能，但是腫瘤細(xì)胞能夠通過(guò)免疫逃逸和免疫抑制躲避免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，目前免疫治療主要包括克服腫瘤的免疫耐受以及激活效應(yīng)細(xì)胞的殺傷作用。既往研究［15-18］發(fā)現(xiàn)，在三陰乳腺癌、結(jié)腸癌、頭頸部鱗癌等多種腫瘤中通過(guò)對(duì)免疫特征進(jìn)行評(píng)估而制定的免疫分型有助于指導(dǎo)治療及改善患者的臨床預(yù)后。本研究通過(guò)分析TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，對(duì)膀胱癌患者進(jìn)行免疫分型，并進(jìn)一步分析了各型的免疫特征與預(yù)后之間的關(guān)系。

圖2 膀胱癌基于免疫基因組學(xué)的分型及ESTIMATE 分析Fig.2 Classification of bladder cancer based on Immunogenomic profiling and ESTIMATE analysis

ICIs 的療效有賴于腫瘤的免疫原性，目前預(yù)測(cè)PD-1 抗體療效的標(biāo)志物主要包括：腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）、腫瘤細(xì)胞PD-L1 表達(dá)水平、腫瘤突變負(fù)荷、錯(cuò)配修復(fù)缺陷/微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定等［19］。腫瘤微環(huán)境是指腫瘤在其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中所處的內(nèi)環(huán)境，由腫瘤細(xì)胞本身、間質(zhì)細(xì)胞、微血管、微淋巴管、組織液、眾多細(xì)胞因子及少量浸潤(rùn)細(xì)胞等共同構(gòu)成，腫瘤微環(huán)境在PD-L1 的調(diào)節(jié)中起著重要作用，其構(gòu)成與ICIs 療效密切相關(guān)［20］。本研究通過(guò)ESTIMATE 分析腫瘤微環(huán)境發(fā)現(xiàn)高免疫組包含的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量最多，并且大部分HLA 基因高表達(dá)，與其他兩組相比具有更強(qiáng)的免疫原性，同時(shí)單基因分析發(fā)現(xiàn)高免疫組的PD-L1 表達(dá)明顯高于其他兩組，提示高免疫組更適合于免疫治療。

圖3 各免疫分型中HLA 及PD-L1、CTLA-4 的基因表達(dá)水平及組間差異Fig.3 Comparison of HLA gene expression and PD-L1/CTLA-4 level between immune groups（ANOVA test，***P ＜0.001）

圖4 免疫分型與腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析Fig.4 Comparison of TIICs levels between different immune groups

表2 高免疫組中顯著上調(diào)的GO 功能集合和KEGG 信號(hào)通路Tab.2 Significantly enriched GO terms and KEGG pathways of Immunity H group

腫瘤微環(huán)境常常能夠抑制活化的T 細(xì)胞進(jìn)入腫瘤組織或阻止效應(yīng)T 細(xì)胞的活化，TIL 數(shù)量與患者的預(yù)后密切相關(guān)［21］。研究［22］表明，CD8+T 細(xì)胞作為消除腫瘤的重要效應(yīng)T 細(xì)胞，有助于延長(zhǎng)患者的總生存及提高免疫治療的療效。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能夠表達(dá)抑制T 細(xì)胞募集和活化的細(xì)胞因子和酶，從而增強(qiáng)對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的耐藥性，目前正在進(jìn)行的眾多臨床實(shí)驗(yàn)旨在抑制巨噬細(xì)胞的增殖或極化，以增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答［23］。與先前研究一致，筆者發(fā)現(xiàn)高免疫組的預(yù)后最好，其中CD8+T 細(xì)胞含量最高，而M0 巨噬細(xì)胞最少。通過(guò)GO 和KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，高免疫組的功能主要富集在MHC Ⅱ類蛋白復(fù)合物、MHC 蛋白復(fù)合物及抗原處理和遞呈等免疫相關(guān)功能上。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了高免疫組具有較高的抗腫瘤免疫活性。

綜上所述，高免疫組的膀胱癌患者預(yù)后最好，并且具有較高的免疫原性及抗腫瘤免疫活性，或許更加適合采用ICIs 治療?；诿庖呋蚪M學(xué)的膀胱癌分型有助于臨床醫(yī)師判斷患者的預(yù)后、選擇優(yōu)勢(shì)治療人群及進(jìn)一步制訂個(gè)體化的免疫治療方案。然而作為一項(xiàng)探索性的研究，該分型在膀胱癌中的應(yīng)用價(jià)值有待于多中心大樣本的臨床研究驗(yàn)證。