方曉明 邵銀燦 郭勝才 婁敏峰 王喜 姚寧

解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第903 醫(yī)院1普通外科，2腫瘤科（杭州310004）

結(jié)直腸癌在我國(guó)是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率已居第三并仍呈上升趨勢(shì)。眾多研究結(jié)果表明：人腸癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展及無(wú)限增殖與多個(gè)癌基因的激活和抑癌基因的失活有關(guān)［1-2］，其中包含有細(xì)胞周期調(diào)控因子—細(xì)胞周期素依賴性激酶抑制因子（cyclin-dependent kinases，CKIs）的表達(dá)沉默，而這種抑癌基因的失活和沉默與腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMTs）過(guò)表達(dá)所致基因啟動(dòng)子區(qū)過(guò)度甲基化相關(guān)［3］。筆者在前期的研究結(jié)果已發(fā)現(xiàn)：人腸癌RKO 細(xì)胞CKIs 的激酶4 抑制因子家族（inhibitors of kinase 4、INK4、p15ink4b及p16ink4a/CDKN2）基因啟動(dòng)子區(qū)5′CpG 島呈高甲基化狀態(tài)，且這種異常的高甲基化具有可逆性［4-5］，但對(duì)其逆轉(zhuǎn)后的增殖侵襲能力尚未明確。故本研究旨在通過(guò)應(yīng)用特異性DNMTs 抑制劑5-氮-2′-脫氧胞苷（5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR）干預(yù)人腸癌RKO 細(xì)胞，探討5-Aza-CdR 對(duì)INK4 家族基因表達(dá)及對(duì)人腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，探索大腸癌治療的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料人結(jié)腸癌細(xì)胞株RKO 由浙江大學(xué)腫瘤研究所提供。5-Aza-CdR、軟瓊脂及吖啶橙購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；單克隆抗體p15ink4b及p16ink4a/CDKN2 購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司；胎牛血清為杭州江濱生物技術(shù)有限公司；DMEM 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)GIBCO 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理人結(jié)腸癌細(xì)胞株RKO在含10%胎牛血清，100 U/mL青酶素，100 U/mL鏈酶素的DMEM 高糖（4 500 mg/L）培養(yǎng)基中，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的飽和濕度箱中培養(yǎng)，每4 ～5 d 消化傳代1 次。

1.2.2 細(xì)胞分組取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞傳代24 h 貼壁后，分為經(jīng)5-Aza-CdR 作用的實(shí)驗(yàn)組及未經(jīng)5-Aza-CdR作用的陰性對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別用1×10-7、5 × 10-7、1 × 10-6mol/L 3 個(gè)不同濃度5-Aza-CdR 作用72 h，繼續(xù)培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)取經(jīng)上述處理前后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按每孔2 × 103個(gè)（200 μL）接種于96孔培養(yǎng)板中，每3 孔為1 組，共7 板，每日1 板加入5 g/L MTT 液20 μL，37 ℃再孵育4 h 后，棄上清，加DMSO 150 μL 振蕩溶解，在570 nm 波長(zhǎng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Opsys MD）上測(cè)定各孔吸光度值（A），求其均值，以A值為縱坐標(biāo)，時(shí)間（d）為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。細(xì)胞增殖抑制率（CPIR）按公式：CPIR=（1-實(shí)驗(yàn)組A均值/對(duì)照組A均值）×100%計(jì)算。

1.2.4 細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)利用Matrigel 膠人工基底膜和Transwell 小室檢測(cè)4 組細(xì)胞的遷移能力，每組各設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞數(shù)為5 × 103個(gè)/孔。DMEM-HG 培養(yǎng)48 h 后，4%多聚甲醛固定，0.1%結(jié)晶紫染色，取微孔膜，倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)取5 個(gè)典型視野觀察計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，求各視野的平均細(xì)胞數(shù)表示腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力。

1.2.5 軟瓊脂克隆細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)取5%瓊脂沸水浴中溶化，將1 份瓊脂與9 份預(yù)溫37℃的DMEMHG 混勻，澆入6 孔培養(yǎng)板中，置室溫下凝固制備底層瓊脂；胰蛋白酶消化RKO 細(xì)胞，分散成單個(gè)細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，調(diào)整各組細(xì)胞密度至1×103個(gè)/mL，置室溫備用。將RKO 細(xì)胞懸液加入鋪有底層瓊脂的6 孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，每孔1.5 mL，置室溫下使瓊脂凝固，制備頂層瓊脂。CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)2 周，加入濃度為10 mg/mL 的吖啶橙1 h 后，在倒置顯微鏡上觀察集落形成情況并隨機(jī)計(jì)數(shù)5 個(gè)典型視野，計(jì)算其平均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.6 免疫組織化學(xué)染色收集各5-Aza-CdR 濃度處理的結(jié)腸細(xì)胞，涂片，乙醇固定，一抗p15ink4b和p16/CDKN2 工作濃度為1∶100（Santa Cruz 公司產(chǎn)品），按試劑盒說(shuō)明常規(guī)SP 染色，DAB 顯色，光鏡觀察，以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，比較細(xì)胞形態(tài)、胞質(zhì)染色強(qiáng)弱及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。定量數(shù)據(jù)以描述，先作正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布且方差齊，則多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和細(xì)胞增殖抑制率經(jīng)不同濃度5-Aza-CdR 處理后，各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線如圖1 所示，經(jīng)統(tǒng)計(jì)符合正態(tài)分布。與未經(jīng)5-Aza-CdR 處理的陰性對(duì)照組比，3 實(shí)驗(yàn)組RKO 細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖活性均有明顯抑制，在2、3、4 d 時(shí)抑制差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.642、3.75、8.86，P＞0.05）；7 d 時(shí)陰性對(duì)照組、0.1 μmol/L 組、0.5 μmol/L 組、1.0 μmol/L 組細(xì)胞的細(xì)胞抑制率分別為（0.00 ± 0.99）%、（40.70±0.54）%、（52.00±1.62）%和（62.62±1.40）%，4組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 347.38，P＜0.01）。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞時(shí)間抑制率見圖2。7 d 時(shí)對(duì)照組分別與0.1 μmol/L 組、0.5 μmol/L 組和1.0 μmol/L組比較（t=62.538、47.457、62.398，P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2）。

圖1 5-Aza-CdR 對(duì)腸癌RKO 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖Fig.1 Growth curve of 5-Aza-CdR on RKO cell lines

圖2 5-Aza-CdR 對(duì)腸癌RKO 細(xì)胞增殖抑制率的影響Fig.2 Inhibition rate of 5-Aza-CdR on RKO cell lines

圖3 軟瓊脂克隆（體外）致瘤性試驗(yàn)（吖啶橙染色×200）Fig.3 Soft agar cloning experiment in vitro（acridine orange staining× 200）

2.2 細(xì)胞遷移和侵襲能力細(xì)胞遷移和侵襲結(jié)果顯示，7 d 時(shí)陰性對(duì)照組、0.1 μmol/L 組、0.5 μmol/L組和1.0 μmol/L 實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移數(shù)目分別為（67.4±7.2）、（35.3±4.6）、（29.5±7.3）和（25.3±6.2）個(gè)。4組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=72.727，P＜0.01）。對(duì)照組分別與0.1 μmol/L 組（t= 9.344，P＜0.05）、0.5 μmol/L 組（t=10.231，P＜0.01）和1.0 μmol/L 組（t= 11.589，P＜0.01）兩兩比較顯示，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 克隆細(xì)胞集落致瘤性實(shí)驗(yàn)結(jié)果體外克隆細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組、0.1 μmol/L 組、0.5 μmol/L 組及1.0 μmol/L 組細(xì)胞集落數(shù)目分別為：（36.8 ± 5.1）、（32.4 ± 7.2）、（21.3 ± 5.4）、（19.5±6.4）個(gè)。4組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.646，P＜0.01）。對(duì)照組分別與0.1 μmol/L 組（t=2.020，P＞0.05）、0.5 μmol/L 組（t= 5.354，P＞0.05）和1.0 μmol/L組（t=6.382，P＜0.05）比較，與1.0 μmol/L實(shí)驗(yàn)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4 組細(xì)胞形成的細(xì)胞集落大小無(wú)明顯差異（圖3）。

2.4 細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果細(xì)胞免疫化學(xué)染色結(jié)果顯示，p15ink4b蛋白和p16ink4a/CDKN2 蛋白陽(yáng)性染色位于細(xì)胞漿，呈黃或棕黃色顆粒，未經(jīng)處理的細(xì)胞胞漿無(wú)或略呈疏黃染顆粒，其大小形態(tài)較一致，核漿比較大。0.1 μmol/L 組、0.5 μmol/L 組、1.0 μmol/L 組細(xì)胞與對(duì)照組比較，細(xì)胞胞漿染色明顯增強(qiáng)，呈黃色或棕黃色，陽(yáng)性細(xì)胞增多，部分胞體變大，核仁清楚，胞漿增多，核漿比變?。▓D4、5，箭頭所指）。

3 討論

圖4 IHC 檢測(cè)5-Aza-CdR 對(duì)RKO 細(xì)胞p16ink4a/CDKN2 蛋白表達(dá)的影響（SP×200）Fig.4 p16ink4a/CDKN2 protein expression of RKO by Immunochemistry（SP×200）

圖5 IHC 檢測(cè)5-Aza-CdR 對(duì)RKO 細(xì)胞p15ink4b蛋白表達(dá)的影響（SP×200）Fig.5 p15ink4b CDKN2 protein expression of RKO by Immunochemistry（SP×200）

已有研究表明，某些腫瘤抑制基因其DNA 序列完整，并未有突變、缺失等變化，無(wú)法解釋其功能的失活，基于對(duì)染色體結(jié)構(gòu)表遺傳調(diào)控的再認(rèn)識(shí)，認(rèn)為堿基胞嘧啶環(huán)甲基化是其沉默原因，且DNA 甲基化貫穿于細(xì)胞癌變的各個(gè)階段，是基因表達(dá)調(diào)控方式之一［1，6-7］。DNA 甲基化是指在DNMTs 催化作用下，由S-腺苷甲硫胺酸（S-adenosylmethionine，SAM）提供甲基，在CpG 二核苷酸5′-端胞嘧啶轉(zhuǎn)變成5′-甲基胞嘧啶的過(guò)程。 近年來(lái)的研究認(rèn)為［8-9］，基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化與癌癥、老年癡呆癥的發(fā)生具有密切聯(lián)系，而這種調(diào)控的關(guān)鍵在于DNMTs 的活性。DNMTs 呈高表達(dá)存在于多種腫瘤中［10-11］，明顯高于增生細(xì)胞，更高于正常細(xì)胞，其活性增高使抑癌基因的CpG 島DNA 甲基化異常，使該基因無(wú)法正常表達(dá)，從而促使腫瘤增殖。本研究MTT 實(shí)驗(yàn)顯示，給予不同濃度特異性DNMTs 抑制劑5-Aza-CdR 作用于腸癌RKO 細(xì)胞后，腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)活性均有顯著抑制，并與5-Aza-CdR 濃度呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，說(shuō)明DNMTs 的活性與腸癌細(xì)胞的分裂生長(zhǎng)有關(guān)，與徐銀輝等［12］報(bào)道的5-氮雜胞苷通過(guò)抑制DNMTs 的活性而使肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖功能減弱甚至喪失結(jié)果相似。

軟瓊脂集落形成試驗(yàn)是測(cè)定單個(gè)細(xì)胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是單個(gè)細(xì)胞在體外持續(xù)增殖后，所組成的細(xì)胞群體成為克隆或集落，通過(guò)計(jì)數(shù)克隆形成率，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞的增殖潛力作出半定量分析，克隆形成率高者其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性及獨(dú)立生存能力強(qiáng)，這也多少反映細(xì)胞惡性程度的特征。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3 個(gè)5-Aza-CdR干預(yù)組RKO 細(xì)胞集落數(shù)均顯著少于對(duì)照組，并與5-Aza-CdR 劑量呈明顯的抑制量效關(guān)系；同樣的細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示腸癌細(xì)胞經(jīng)5-Aza-CdR 作用后遷移數(shù)較對(duì)照組顯著降低，兩實(shí)驗(yàn)呈現(xiàn)出相近的結(jié)果，均提示5-Aza-CdR 能有效抑制腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲力，并與5-Aza-CdR 濃度呈正相關(guān)；LI 等［13］報(bào)道5-Aza-CdR 通過(guò)下調(diào)Wnt 信號(hào)通路抑制腸癌干細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)；而MAIURI 等［14］則通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示相近結(jié)果，他們?cè)谛∈蠼Y(jié)腸腫瘤模型中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用DNMTs 抑制劑能有效降低腫瘤的致瘤性。

本研究進(jìn)一步探討了5-Aza-CdR 對(duì)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制作用的可能相關(guān)機(jī)制。我們選擇了一類重要的細(xì)胞周期調(diào)控因子----細(xì)胞增殖抑制因子INK4（Inhibitor of CDK4）家族基因p15ink4b、p16ink4a/CDKN2 作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，它是特異性針對(duì)細(xì)胞周期素依賴激酶（cyclin-dependent kinasds）CDK4及CDK6 的腫瘤抑制基因，參與細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控，可防止細(xì)胞過(guò)度增殖和惡變［15］，在前期實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，該基因啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化，且這種異常的高甲基化可被5-Aza-CdR 逆轉(zhuǎn)［4］。在本研究應(yīng)用細(xì)胞免疫組化方法顯示，通過(guò)5-Aza-CdR 作用后腸癌p15ink4b、p16ink4a/CDKN2 蛋白均進(jìn)一步激活，表現(xiàn)為細(xì)胞胞漿染色黃色或棕黃色，表達(dá)增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞增多，部分胞體變大，核仁清楚，胞漿增多，核漿比變小，顯現(xiàn)出一定的療效關(guān)系，由此推究，腸癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)可能與5-Aza-CdR 逆轉(zhuǎn)p15ink4b及p16ink4a/CDKN2 基因啟動(dòng)子區(qū)異常高甲基化從而激活蛋白表達(dá)、參與細(xì)胞負(fù)調(diào)控相關(guān)。因INK4 家族基因（p15ink4b及p16ink4a/CDKN2）為細(xì)胞周期G1/S 限制點(diǎn)負(fù)相關(guān)調(diào)控因子之一，即可抑制細(xì)胞從G1 進(jìn)入S 期［16］，也間接推斷5-Aza-CdR 與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)有關(guān)，國(guó)外學(xué)者已作類似結(jié)論［17］，這點(diǎn)仍需實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步支持。

綜上所述，腸癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展機(jī)制較為復(fù)雜，參與的基因眾多，具體是何種敏感性高特異性基因異常甲基化導(dǎo)致腸癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展尚不清楚，DNMTs 的高表達(dá)使眾多的抑癌基因失活沉默，但同時(shí)存在著許多癌基因表達(dá)增強(qiáng)，也有可能與腫瘤細(xì)胞的凋亡功能減弱相關(guān)［18-19］。本研究表明5-Aza-CdR 作為DNMTs 抑制劑的確具有抑制腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和侵襲能力，p15INK4b及p16ink4a/CDKN2 基因表達(dá)的激活可能是其機(jī)制之一，但對(duì)其他抑癌基因/癌基因影響如何仍待進(jìn)一步研究；另外，本研究只是進(jìn)行了細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)，缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的有力支持，下一步值得探討5-Aza-CdR對(duì)腸癌的動(dòng)物模型的療效及預(yù)后，以及聯(lián)合其他化療藥物治療的有效性。