蘇海容 袁秋虹 歐陽菁 鄧偉民

1南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院內六科（廣州510010）；2廣州中醫(yī)藥大學（廣州510405）

隨著我國人口老齡化的加劇，骨質疏松癥（osteoporosis，OP）已成為我國面臨的重要公共健康問題，嚴重威脅人們的健康及生活質量。前期研究發(fā)現(xiàn)老年男性的骨密度（bone mineral density，BMD）與總脂肪含量（total fat mass，TFM）和總肌肉含量（total lean mass，TLM）呈正相關［1］。老年人常有肌無力、骨骼肌含量減少、腹部脂肪增加、運動能力減退和骨密度降低等表現(xiàn)，這些與增齡引起生長激素（human growth hormone，GH）分泌不足有關，生長激素替代治療可以提高肌肉含量及肌肉力量、減少脂肪含量和增加骨密度［2-3］，骨密度的增加可能與GH 治療調節(jié)體質成分有關。但重組人生長激素（recombinant human growth hormone，rhGH）替代治療仍有很多問題有待探討：治療的最佳劑量、是否引發(fā)惡性腫瘤及不良反應等［4-5］。補腎壯骨顆粒治療骨質疏松癥的療效已得到證實［6］。本試驗以快速老化雄性小鼠（senescence acceleratedmale mice，SAMP6，P6）為研究對象，采用皮下注射rhGH 及補腎壯骨顆粒灌胃治療進行研究，再次驗證補腎壯骨顆粒對老年男性骨質疏松癥骨密度提高的有效性，探討其對骨密度作用機理是否與調節(jié)體質成分有關，為臨床應用提供更多的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物3月齡雄性SAMP6 品系小鼠共40只，正常老化同源對照小鼠SAMR1 共10 只，均由天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院實驗動物中心提供（批號：No.12002900000012，清潔級）。

1.2 實驗藥物補腎壯骨顆粒（10 g/袋，廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，批號15K04001），主要由龜板膠、鹿角膠、生地、山藥、骨碎補、淫羊藿、水蛭等組成。尤得盼注射用rhGH（1.33 mg/瓶，（株）LG 生命科學，進口藥品注冊證號S20140029，生產批號UTR15020）。

1.3 實驗器材雙能X 線（DEXA）骨密度儀（生產廠家：美國GE 公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗分組與干預方法10 只3 個月齡雄性SAMR1 小鼠作為同源對照組。3月齡雄性SAMP6品系小鼠共40 只，分為4 組，每組各10 只。具體分組及干預情況見表1。

表1 實驗動物分組及干預情況Tab.1 Grouping and intervention of experimental animals

所有小鼠在完全相同的條件下飼養(yǎng)，自由采食飲水。小鼠用藥劑量根據(jù)人和動物體表面積與劑量換算比計算所得［7］，給藥后每周稱量體質量1 次，根據(jù)體質量調整受試藥物劑量。干預3 個月后每組隨機選取5 只進行測量骨密度及體質成分測量，剩下的再繼續(xù)前方式干預，3 個月后采取同樣的方法測量。

1.4.2 觀察指標分別于干預3 個月和6 個月后，用雙能X 線骨密度測量儀測對實驗小鼠進行活體骨密度（BMD）、骨礦含量（BMC）、全身肌肉含量（TLM）、全身脂肪含量（TFM）及全身脂肪百分比（FM）檢測。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以（）表示；多組間比較采用單因素方差分析，聯(lián)合用藥組的比較采用析因設計的方差分析，Boferoni 法校正，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體質量增長結果各組體質量在實驗期間均隨飼養(yǎng)時間延長而增加：（1）干預3 個月后，空白對照組較同源對照組體質量高（P＜0.05）；干預6 個月后，聯(lián)合用藥組較同源對照組體質量高（P＜0.05）。（2）兩階段干預后，P6 品系各組間比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），P6 品系組間具有齊同可比性。見表2。

表2 干預3 個月組及6 個月后體質量比較Tab.2 Comparison of Weight after 3 Months and 6 MonthsIntervention ±s，g

表2 干預3 個月組及6 個月后體質量比較Tab.2 Comparison of Weight after 3 Months and 6 MonthsIntervention ±s，g

注：與同源對照組相比，*P ＜0.05；與空白對照組相比，△P ＜0.05；與補腎壯骨組比，#P ＜0.05；與rhGH 組相比，□P ＜0.05

組別同源對照組空白對照組補腎壯骨組rhGH 組聯(lián)合用藥組例數(shù)5 5 5 5 5干預3 個月25.80±1.92 29.60±1.95*31.00±0.71*29.6±1.82*30.80±1.30*干預6 個月26.40±0.89 30.80±2.50*31.80±2.59*30.60±2.88 30.20±1.48

2.2 TLM、TFM 和FM 比較TLM 比較：兩階段干預后均表現(xiàn)為：（1）同源對照組低于空白對照組（P＜0.05）；（2）rhGH 組、補腎壯骨組及聯(lián)合用藥組高于空白對照及同源對照組（P＜0.05）；3 組藥物干預組比較差異差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

TFM 比較：兩階段干預后均表現(xiàn)為：（1）同源對照組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；（2）與空白對照組相比，rhGH 組、補腎壯骨組及聯(lián)合用藥組有所下降（P＜0.05）；但3 組用藥藥物干預組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

FM 比較：（1）3 個月干預后，同源對照組較空白對照組高（P＜0.05），干預6 個月后，此兩組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；（2）兩階段干預后，均表現(xiàn)為與空白對照組比較，rhGH 組、補腎壯骨組及聯(lián)合用藥組有所下降，3 組藥物干預組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

各藥物干預組小鼠的TLM、TFM 和FM（%）組間比較經(jīng)析因設計的方差分析處理：總的校正模型均差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），干預3 個月及6 個月后發(fā)現(xiàn)，補腎壯骨顆粒與rhGH 間均存在負交互作用（F=5.521、7.118、13.697、9.484、10.667、27.334，均P＜0.05）。見表4 和圖1。

表4 TLM、TFM 和FM 析因設計的方差分析Tab.4 Factorial design analysis of variance of TLM，TFM and FM

圖1 兩種藥物對TLM、TFM 和FM 影響的交互作用示意圖Fig.1 Factorial design analysis of variance of TLM，TFM and FM

表3 各組TLM、TFM 和FM 比較Tab.3 The Comparison of TLM，TFM and FM in each group ±s，g

表3 各組TLM、TFM 和FM 比較Tab.3 The Comparison of TLM，TFM and FM in each group ±s，g

注：與同源對照組相比，*P ＜0.05；與空白對照相比，△P ＜0.05；與補腎壯骨組相比，#P ＜0.05

組別同源對照組空白對照組補腎壯骨組rhGH 組聯(lián)合用藥組干預3 個月TLM 17.6±1.51 22.6±1.14*26.2±0.84*△25.6±1.95*△26.4±1.14*△TFM 7.4±1.52 6.2±1.30 4.2±0.84*3.2±0.84*△3.4±0.55*△FM（%）29.86±4.75 20.82±2.95*13.72±2.44△10.82±2.12△11.26±1.27△干預6 個月TLM 17.4±1.14 20.4±0.90*24.0±2.00*△24.2±1.92*△23.6±0.89*△TFM 8.2±1.30 9.6±1.52 6.8±0.84△5.6±0.90*△6.0±1.00△FM（%）31.34±4.30 31.20±2.92 21.34±1.67△18.74±1.87△19.48±2.40△

2.3 骨密度和骨礦含量比較BMD 比較：（1）兩階段干預后，同源對照組均較空白對照組（P＜0.05）；（2）3 個月干預后，與空白對照組比較，rhGH組及聯(lián)合用藥組未見明顯變化（P＞0.05），補腎壯骨組有所上升（P＜0.05）；（3）6 個月干預組后，與空白對照組比較，rhGH 組、補腎壯骨組及聯(lián)合用藥組均有上升（P＜0.05），3 組藥物干預組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表5。

BMC 比較：（1）兩階段干預后，同源對照組均比空白對照組高（均P＜0.05）；（2）與空白對照組相比較，rhGH 組及聯(lián)合用藥組未見明顯變化（P＞0.05），補腎壯骨組有所上升（P＜0.05）；補腎壯骨組高于rhGH 組及聯(lián)合用藥組（P＜0.05）；（3）6 個月干預后，與空白對照組相比較，rhGH組、補腎壯骨及聯(lián)合用藥組均有所上升（P＜0.05）；補腎壯骨組高于rhGH 組及聯(lián)合用藥組（P＜0.05）。見表5。

表5 各組BMD 及BMC 比較Tab.5 Comparison of BMD and BMC in each group ±s

表5 各組BMD 及BMC 比較Tab.5 Comparison of BMD and BMC in each group ±s

注：與同源對照組組相比，*P ＜0.05；與空白對照相比，△P ＜0.05，與補腎壯骨相比，#P ＜0.05

組別同源對照組空白對照組補腎壯骨組rhGH 組聯(lián)合用藥組干預3 個月BMD（g/cm2）0.070±0.004 0.064±0.002*0.069±0.002△0.062±0.003*#0.066±0.004 BMC（g）0.598±0.013 0.534±0.030*0.634±0.050△0.542±0.008#0.566±0.034#干預6 個月BMD（g/cm2）0.071±0.003 0.061±0.001*0.072±0.004△0.070±0.002△0.071±0.002△BMC（g）0.600±0.049 0.510±0.039*0.702±0.029*△0.592±0.033△#0.606±0.050△#

各藥物干預組小鼠的BMD 和BMC 組間比較經(jīng)析因設計的方差分析處理：總的校正模型差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），干預3個月及6個月后，補腎壯骨組與rhGH 組間對小鼠BMC 的影響均存在負交互作用（F= 6.265，26.536，均P＜0.05）。干預3 個月后，補腎壯骨顆粒與rhGH 對小鼠BMD的影響不存在交互作用（F= 0.441，P= 0.516）。干預6 個月后，補腎壯骨顆粒與rhGH 對小鼠BMD的影響存在負交互作用。見表6 和圖2。

表6 BMD 及BMC 的析因方差分析Tab.6 Factorial design analysis of variance of BMD and BMC

3 討論

老年性骨質疏松癥的出現(xiàn)與多種因素相關，隨著年齡的增長而逐漸降低的GH 是其中的一個重要原因。伴隨著GH 下降，肌肉含量減少及脂肪組織增加［8］，從而導致機體活動功能減退，最終出現(xiàn)老年性骨質疏松。有研究發(fā)現(xiàn)對成人GH 缺乏患者采用rhGH 替代治療可增加瘦體質量、降低脂肪含量、增加脊柱BMD 及提高等距屈膝力量，另外可阻止由正常老化導致的肌肉性能和神經(jīng)肌肉功能減退［9-12］。但也有研究發(fā)現(xiàn)成年人GH 替代治療可以延緩肌肉力量的下降，運動能力未發(fā)現(xiàn)提高［13-14］，這可能除了肌肉本身的影響外，關節(jié)運動功能的好壞和神經(jīng)信號的強弱也與活動能力有關。血清IGF-1 濃度與BMD、BMC、脂肪含量和瘦體質量呈正相關［15］，肌肉特定部位的IGF-1 表達可提高肌肉的再生能力和防治肌纖維化［16］?？梢?，GH/IGF-1 軸本身除了直接影響成骨細胞及破骨細胞外［17］，還可能影響體質成分進而間接對BMD 產生影響。團隊前期研究發(fā)現(xiàn)補腎壯骨顆粒對快速老化雄性小鼠BMD 的影響可能通過調節(jié)GH/IGF-1軸的功能實現(xiàn)，因此，筆者猜想補腎壯骨顆粒提高BMD 的作用與rhGH 替代治療相似，同樣對體質成分有影響。因此，本研究試圖從調節(jié)體質成分方面進一步比較二者的作用，為在骨質疏松癥治療中以補腎壯骨顆粒替代rhGH 提供更多的依據(jù)。

圖2 兩種藥物對BMC 和BMD 影響的交互作用示意圖Fig.2 Factorial design analysis of variance of BMD and BMC

快速老化小鼠SAM（Senescence accelerated mouse），是日本京都大學培育繁殖的快速老化動物模型，分為兩個品系：一為正常老化的R 品系，二為快速老化的P 品系。R 品系的各項老化速度、生理指標和正常小鼠類似，而SAMR1 通常被用作正常老化對照組。P品系老化速度加快，在4 ～6個月齡時就已經(jīng)迅速出現(xiàn)老化病理現(xiàn)象［18］。其中SAMP6 是唯一一種已經(jīng)被證實可隨年齡增長出現(xiàn)脆性骨折的動物模型［19］，常被用為老年性骨質疏松動物模型。本研究發(fā)現(xiàn)同源對照組小鼠的BMD較P6 空白對照組小鼠高，采用P6 小鼠作為老年性骨質疏松模型進行本實驗研究，具有一定意義。

骨質疏松屬于中醫(yī)“骨枯”、“骨萎”、“骨痹”和“腰背痛”等范圍，致病因素多為腎虛、脾虛、肝郁、血瘀。在老年性骨質疏松的發(fā)病過程中，骨質疏松癥主要病機為脾腎兩虛，肝郁血瘀。補腎壯骨顆粒是鄧偉民教授治療骨質疏松癥的驗方，此方正是針對這些病因病機，從補腎健脾和化瘀方面著手治療。近年臨床研究發(fā)現(xiàn)補腎壯骨顆粒在老年男性骨質疏松癥患者的治療中療效確切，可改善骨代謝、增加BMD、降低骨折率及緩解骨痛［20-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，干預3 個月及6 個月后，補腎壯骨顆粒干預組BMD 均有提高，再次驗證了補腎壯骨顆粒治療老年男性骨質疏松癥的療效。

本實驗發(fā)現(xiàn)干預3 個月后，3 組藥物干預組TLM 提高及FM 下降，補腎壯骨顆粒組的BMD 及BMC 均有所上升，但rhGH 及聯(lián)合用藥組BMD 和BMC 未見明顯變化。干預6 個月時后，3 組藥物干預的TFM 及FM（%）均有所下降、TLM 及BMD 和BMC 均有所上升，但補腎壯骨顆粒組的BMC 較rhGH 組及聯(lián)合用藥組高。表明rhGH 替代治療要獲得與補腎壯骨顆粒組同樣的BMD 變化需要延長治療時間，本研究中rhGH 治療可降低TFM 和增加TLM 及BMD 的結果與前研究一致。從實驗結果看，聯(lián)合用藥組和單獨用藥組未見明顯優(yōu)勢，通過析因方差分析發(fā)現(xiàn)，補腎壯骨顆粒與rhGH 存在拮抗作用，結合前期研究，考慮兩種藥物對體質成分的影響均可能通過GH/IGF-1 共同信號通路實現(xiàn)，因此，兩種藥物在治療骨質疏松時不宜聯(lián)合使用。

本研究存在一定的局限性，肌肉對骨的影響主要是通過肌肉收縮的力量及機體的運動能力實現(xiàn)，而本實驗中對肌肉的評估主要依靠DXA 進行，未能對肌肉功能如肌肉強度及運動功能進行評估。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)補腎壯骨顆?？山档蚑FM 及FM（%）和提高TLM 及BMD，3 個月治療效果較rhGH 佳，6 個月治療效果與rhGH 相當。結合前期研究，補腎壯骨顆粒在老年性骨質疏松治療方面可能可替代rhGH。下一步實驗將采取措施對肌肉功能和運動能力進行評估。