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        His-prescission蛋白酶基因在大腸桿菌中表達條件的優(yōu)化

        2020-07-01 07:00:46蔡莉王甫群
        安徽化工 2020年3期
        關(guān)鍵詞:感受態(tài)誘導(dǎo)劑液量

        蔡莉,王甫群

        (1.江陰職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與材料工程系,江蘇江陰214405;2.無錫佰翱得生物科學(xué)有限公司,江蘇江陰214431)

        His-prescssion 蛋白酶是一種帶有便于分離純化的His 標簽的蛋白酶,其上的His 標簽將會在最后純化分離中除去,留下的就是PreScission 蛋白酶。PreScission蛋白酶是一種遺傳改造的融合蛋白,由人鼻病毒3C 蛋白酶(HCV3C)和GST 組成[1]。這種蛋白酶是專為蛋白酶的去除而設(shè)計,能同時實現(xiàn)蛋白酶的固定和pGEX-6P 載體(pGEX-6P-1、pGEX-6P-2 和 pGEX-6P-3)所產(chǎn)生的GST 融合蛋白的切割[2]。PreScission 蛋白酶能特異切割Glu和Gly殘基之間的識別序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro,在4℃左右酶活最高,所以酶切在4℃左右時進行,既可以保持目的蛋白的穩(wěn)定性,又能達到最佳酶切效果。在5℃,50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT(pH 7.0)的反應(yīng)體系中,一個單位酶 16 h 可切割 100 μg 待測 GST 標簽蛋白,切割效率在90%以上[3]。

        PreScission 蛋白酶作為在蛋白分離純化過程中應(yīng)用在親和純化時的酶切用酶,在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價值,其應(yīng)用廣泛,具有很高的生物科研價值和經(jīng)濟價值,如上海七海復(fù)泰生物科技有限公司生產(chǎn)的PreScission Protease100U 市場售價為750 元,進口的則更加昂貴。隨著現(xiàn)代生物科技的不斷發(fā)展與壯大,Pre?Scission 蛋白酶的應(yīng)用范圍與應(yīng)用價值也會提高,其經(jīng)濟價值不可小覷。

        1 材料與方法

        1.1菌種

        大腸桿菌感受態(tài)細胞,BL21(DE3)-T1R,北京天根生化科技有限公司;Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3),上海拜力生物科技有限公司。

        1.2 試劑及儀器

        核酸蛋白測定儀,賽默飛世爾科技公司;雙穩(wěn)定電泳儀,北京六一儀器廠;干浴微量恒溫器、脫色搖床,其林貝爾儀器制造有限公司;紫外分光光度計,上海優(yōu)尼柯有限公司;雙層試管搖床,上海智城分析儀器制造有限公司;生物潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

        1.3質(zhì)粒的提取及菌種的轉(zhuǎn)化

        ①含His-prescisssion 基因的質(zhì)粒的菌種復(fù)壯;②含His-prescisssion 基因的質(zhì)粒的提??;③大腸桿菌菌種的轉(zhuǎn)化。

        1.4 His-prescission蛋白酶的表達及流程

        (1)His-prescission蛋白酶的表達

        本蛋白來源為大腸桿菌,屬于初級代謝產(chǎn)物,大腸桿菌與本蛋白酶的生產(chǎn)關(guān)系為生產(chǎn)產(chǎn)物偶聯(lián)型。該目的蛋白在表達過程中,在不加誘導(dǎo)劑前,可少量表達或不表達,加入適量的誘導(dǎo)劑后可大量表達。在37℃誘導(dǎo)表達時,可形成大量包涵體,在分離純化過程可經(jīng)復(fù)性加工使其恢復(fù)生物活性。

        (2)His-prescission酶的表達流程(圖1)

        圖1 His-prescission酶的表達流程圖

        1.5 分析方法

        生物量的測定:取1 mL 發(fā)酵培養(yǎng)液至比色皿中,用紫外可見分光光度計于600 nm(OD600 nm)處測定吸光值。

        發(fā)酵液中目的蛋白的測定:取1 mL 發(fā)酵培養(yǎng)液至比色皿中,用紫外可見分光光度計于600 nm(OD600 nm)處測定吸光值。根據(jù)經(jīng)驗公式:取樣量=0.5/吸光值。將取好的樣按SDS-PAGE 電泳的操作步驟完成蛋白樣的制備及SDS-PAGE 電泳,看聚丙烯酰胺凝膠電泳圖,根據(jù)目的蛋白條帶的顏色深淺和條帶的面積大小,判斷目的蛋白的表達結(jié)果。

        2 實驗結(jié)果

        (1)小劑量表達

        在本試驗中,分別選取BL21(DE3)-TIR、Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3)三種感受態(tài)細胞作為重組基因His-prescission 的宿主菌,探討重組基因在這3 種感受態(tài)的表達效果。

        圖2 轉(zhuǎn)化BL21(DE3)和Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3)蛋白表達結(jié)果

        實驗結(jié)果分析:His-prescission 蛋白酶的條帶位置在 17.5 kDa 處,由圖 2 轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)和 Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3)蛋白表達結(jié)果可看出,以BL21(DE3)-T1R作為宿主菌,目的蛋白表達量最大,所以感受態(tài)BL21(DE3)-T1R 為表達His-prescission 蛋白酶的最佳宿主菌。感受態(tài)細胞Rosetta2(DE3)表達His-prescission 蛋白酶的表達量次之。感受態(tài)細胞Origami2(DE3)表達Hisprescission蛋白酶最少。

        (2)大劑量表達

        在9 個3 L 的大搖瓶上寫好標簽,每個搖瓶內(nèi)加入600 μL 的 Kana 抗生素,將 20 mL 菌種加到 1 200 mL LB液體培養(yǎng)基內(nèi),使用橡皮筋扎緊封口膜,分別放入三個搖床培養(yǎng),待生物量長至相應(yīng)的誘導(dǎo)時機時,加入IPTG 誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后取200 μL的菌液稀釋5倍后在600 nm下測OD值,取樣跑SDS-PAGE[4-6]。

        圖3 正交試驗蛋白表達結(jié)果

        由實驗結(jié)果分析表1,得出結(jié)論:

        (1)當培養(yǎng)條件為搖瓶裝液量為1 200 mL,接種量為20 mL,培養(yǎng)溫度為37℃,搖床轉(zhuǎn)速為130 rpm,誘導(dǎo)時機為1.0時加入IPTG 0.1 mM,誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后,培養(yǎng)基中菌體濃度最高。

        (2)當培養(yǎng)條件為搖瓶裝液量為1 200 mL,接種量為20 mL,培養(yǎng)溫度為37℃,搖床轉(zhuǎn)速為130 rpm,誘導(dǎo)時機為0.7時加入IPTG 0.1 mM,誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后,單位菌體內(nèi)蛋白表達量最高。

        (3)由此可以看到以兩種結(jié)果分析得到誘導(dǎo)時機不同,所以將上述正交實驗的生物量和蛋白表達量作了對比,如圖4所示。

        圖4 正交實驗的生物量和蛋白表達量對比

        由圖3、圖4 可見,8 號的生物量和蛋白表達量都很高,8 號的培養(yǎng)條件是:搖瓶裝液量為1 200 mL,接種量為20 mL,培養(yǎng)溫度為37℃,搖床轉(zhuǎn)速為130 rpm,誘導(dǎo)時機為0.7 時加入IPTG 0.1 mM,誘導(dǎo)表達6 h。故而表達His-prescission 蛋白酶在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達的最佳誘導(dǎo)時機為0.7。

        表1 正交實驗結(jié)果分析表

        3 總結(jié)

        本文利用質(zhì)粒提取試劑盒將含有His-prescission基因的質(zhì)粒從宿主菌BL21(DE3)中提取出來,再分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)-T1R、Rosetta2(DE3)、Origami2(DE3),以感受態(tài)細胞作為變量,試管裝液量、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)溫度、接種量、IPTG 加入量作為固定量,通過單因素實驗得出大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)-T1R 為最佳宿主菌。然后采用正交實驗,進一步探討His-prescission 蛋白酶在大腸桿菌BL21(DE3)-T1R 中的最佳表達條件。在正交試驗中,以搖床轉(zhuǎn)速代替溶氧量,以IPTG 作為誘導(dǎo)劑,選擇合適的誘導(dǎo)時機加入適量的誘導(dǎo)劑,誘導(dǎo)培養(yǎng)一段時間后檢測其生物量和蛋白表達效果。以大劑量表達的方式,通過正交實驗優(yōu)化His-prescission蛋白酶在大腸桿菌中的最佳表達條件,最佳發(fā)酵工藝參數(shù):培養(yǎng)基初始pH 7.0,搖床轉(zhuǎn)速130 rpm,搖瓶裝液量1 200 mL,接種量20 mL,培養(yǎng)溫度37℃,OD 值達到0.7時,IPTG 0.1 mM/mL,誘導(dǎo)表達時間6 h。

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