王茜青， 洪 娟， 杜 超， 褚慶華

（1.上海市浦東新區(qū)浦興社區(qū)衛(wèi)生服務中心檢驗科，上海 200129；2.同濟大學附屬第十人民醫(yī)院檢驗科，上海 200072）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種常見的慢性肝臟硬變性疾病，其疾病進展與肝炎、肝纖維化乃至肝細胞肝癌的發(fā)生相關[1]。目前，肝臟穿刺活檢是診斷NAFLD的“金標準”，但由于其有創(chuàng)，操作要求高，無法實現(xiàn)快速實時的檢測需求，并存在一定的取樣誤差，無法作為NAFLD分級診斷的常規(guī)方法[2]。因此，臨床亟需用于NAFLD早期診斷及進展評估的新型、敏感且特異的血清學指標。組織蛋白酶家族是人溶酶體內(nèi)重要的水解酶家族，共有15個成員[3]，其中組織蛋白酶D（cathepsin D，CTSD）是被發(fā)現(xiàn)最早，且報道最多的一個成員，不僅在溶酶體內(nèi)降解蛋白質(zhì)，還能分泌至細胞外發(fā)揮作用[4]。有研究結(jié)果顯示，CTSD不僅參與了炎癥反應過程，同時也是脂質(zhì)堆積和代謝通路的重要功能蛋白，其與動脈粥樣硬化、腫瘤等多種慢性疾病的發(fā)展密切相關[5-7]。目前，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）等血清學指標已作為NAFLD的常規(guī)輔助診斷項目，但對于NAFLD的分級缺乏特異性和敏感性。因此，本研究擬探討CTSD、ALT、AST等指標聯(lián)合檢測在NAFLD中的臨床價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2016年3月—2019年3月同濟大學附屬第十人民醫(yī)院確診的NAFLD患者356例，年齡（48.87±6.98）歲，參照《非酒精性脂肪性肝病診療指南（2018年更新版）》[1]相關診斷標準確診。按疾病嚴重程度將NAFLD患者分為輕度組（146例，其中男84例、女62例）、中度組（113例，其中男66例、女47例）和重度組（97例，其中男55例、女42例）。納入和排除標準：（1）就診資料、治療經(jīng)過等病史記錄完整；（2）無飲酒史或飲酒折合乙醇量＜140 g/周（女性＜70 g/周）；（3）排除病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病等可導致脂肪肝的特定肝臟疾??；（4）排除藥物、甲狀腺功能減退以及與胰島素抵抗相關的綜合征等特殊情況；（5）排除正在服用或近期內(nèi)曾服用可導致肝臟酶譜升高的藥物者。選取同期同濟大學附屬第十人民醫(yī)院體檢健康者300名（正常對照組），其中男171名、女129名，年齡（47.58±5.66）歲，腹部B超、生化檢查均正常。本研究經(jīng)同濟大學附屬第十人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有對象均自愿參加并簽署知情同意書。

1.2 樣本采集

采用真空采血管采集所有對象清晨空腹靜脈血5 mL，室溫下靜置30 min，待自然凝集后1 000×g離心10 min，分離血清，置于-70 ℃保存，統(tǒng)一檢測。

1.3 方法

采用紫外連續(xù)監(jiān)測法檢測ALT、AST、γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶（gamma-glutamyltransferase，GGT），采用終點法檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C），試劑盒均購自瑞士羅氏公司，檢測儀器為cobas c702全自動生化分析儀（瑞士羅氏公司）。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測CTSD，試劑盒購自武漢優(yōu)爾生公司，標準曲線r2=0.974 6，線性范圍為46.88～3 000.00 pg/mL，最低檢測限為20.32 pg/mL，批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為10%、12%。檢測儀器為ELx800酶標儀（美國BioTek公司）。嚴格按試劑和儀器說明書進行操作。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用Graphpad 7.0軟件及SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用Kolmogrrov-Smimov檢驗進行正態(tài)性檢驗。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個組之間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用q檢驗。采用Pearson相關分析和Spearman等級相關分析評估各項目之間及與NAFLD嚴重程度的相關性。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估各項指標診斷NAFLD的價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NAFLD組與正常對照組各項指標的比較

NAFLD組血清ALT、TC、TG、LDL-C、CTSD水平高于正常對照組（P＜0.01），且NAFLD各組之間差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。NAFLD組血清AST、GGT水平高于正常對照組（P＜0.01），且NAFLD重度組高于中度組（P＜0.01）。NAFLD輕度組與正常對照組之間血清AST、GGT水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 正常對照組與NAFLD組各項指標的比較 ±s

表1 正常對照組與NAFLD組各項指標的比較 ±s

注：與正常對照組比較，*P＜0.01；與輕度組比較，#P＜0.01；與中度組比較，△P＜0.01

組別 例數(shù) ALT/（U/L） AST/（U/L） GGT/（U/L）NAFLD組 356 40.60±16.32* 35.21±13.86* 46.31±24.26*輕度組 146 31.34±8.06* 27.69±7.36* 34.15±14.34*中度組 113 40.09±9.05*# 32.65±8.58*# 45.95±18.46*#重度組 97 55.9±20.26*#△ 50.16±14.59*#△ 65.76±29.37*#△正常對照組 300 24.70±9.61 27.65±7.27 35.00±13.39組別 TG/（mmol/L） TC/（mmol/L） LDL-C/（mmol/L） CTSD/（pg/mL）NAFLD組 1.95±0.50* 5.52±0.97* 3.65±0.55* 18.45±7.18*輕度組 1.61±0.30* 4.91±0.49* 3.38±0.33* 14.25±3.53*中度組 2.00±0.33*# 5.41±0.36*# 3.59±0.3*# 18.31±5.72*#重度組 2.44±0.47*#△ 6.67±0.73*#△ 4.19±0.46*#△ 25.24±7.58*#△正常對照組 1.01±0.48 2.81±1.37 1.95±1.00 7.20±3.76

2.2 血清CTSD水平與NAFLD嚴重程度的相關性

Spearman等級相關分析結(jié)果顯示，血清CTSD水平與NAFLD嚴重程度呈正相關（rs=0.800 5，P＜0.000 1）。見圖1。

圖1 血清CTSD與NAFLD嚴重程度的相關性分析

2.3 血清CTSD與ALT、TC和LDL-C的相關性分析

Pearson相關分析結(jié)果顯示，CTSD與ALT、TC、LDL-C呈正相關（r值分別為0.541、0.662、0.571，P＜0.01）。見圖2。

2.4 CTSD、ALT、GGT診斷NAFLD的價值

ROC曲線分析結(jié)果顯示，CTSD、ALT、GGT診斷NAFLD的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.940、0.822、0.627，最佳臨界值分別為12.67、38.00、53.00，敏感性分別為76.97%、51.69%、34.55%、特異性分別為91.33%、93.00%、92.33%。CTSD與ALT聯(lián)合檢測診斷NAFLD的AUC為0.960，敏感性和特異性分別為88.48%和90.00%。見表2、圖3。

圖2 CTSD與ALT、TC和LDL-C的相關性分析

表2 CTSD、ALT、GGT診斷NAFLD的ROC曲線參數(shù)

圖3 CTSD、ALT、GGT診斷NAFLD的ROC曲線

3 討論

NAFLD是常見的慢性肝病，威脅著全世界20%～30%成人的身體健康[8]。大多數(shù)NAFLD患者合并有代謝性疾病，如肥胖、糖尿病及脂類代謝紊亂等。肝臟的脂肪變性在早期階段通過運動、飲食、藥物等的調(diào)節(jié)是可以逆轉(zhuǎn)的，因此NAFLD的早期診斷對于治療尤為關鍵[9]。The Protein Atlas數(shù)據(jù)庫顯示肝細胞內(nèi)富含CTSD蛋白。一項由美國、芬蘭合作的多中心研究結(jié)果顯示，在西方人群中，血漿CTSD水平與NAFLD的進展密切相關，且可用于預測NAFLD的療效[10]。目前尚無我國人群CTSD水平與NAFLD分級關系的相關報道。本研究結(jié)果顯示，血清CTSD水平與NAFLD分級呈正相關（rs=0.800 5，P＜0.000 1），且與血清ALT水平呈正相關（r值分別為0.541，P＜0.01）。本研究結(jié)果還顯示，NAFLD輕度組血清CTSD水平高于正常對照組（P＜0.01）；而作為脂肪肝輔助診斷指標的ALT、AST，在正常對照組與NAFLD輕度組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。因此，CTSD或可作為新的NAFLD輔助診斷指標。

肝臟是合成、儲存、轉(zhuǎn)運和分解脂質(zhì)的重要器官及場所，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。肝臟一旦發(fā)生脂質(zhì)代謝異常，脂質(zhì)沉積會引起肝細胞脂肪變性，同時誘導氧化應激、肝細胞損傷及炎性細胞浸潤，導致NAFLD發(fā)生，嚴重者可發(fā)展為不可逆的肝病，如肝硬化、肝癌等。有研究結(jié)果顯示，非酒精性肝炎、動脈粥樣硬化等慢性炎癥疾病會引起巨噬細胞溶酶體膽固醇蓄積，而組織蛋白酶在調(diào)節(jié)炎癥反應和膽固醇轉(zhuǎn)運的通路中是不可或缺的重要蛋白[11-12]。本研究結(jié)果顯示，CTSD與TG、TC呈正相關（r值分別為0.662、0.571，P＜0.01），與文獻報道一致[10]。

CTSD是溶酶體中主要的水解酶，存在于哺乳動物所有的細胞和組織中，在細胞中發(fā)揮剪切、降解多種蛋白質(zhì)和多肽的作用，并參與免疫調(diào)控進程。正常情況下，巨噬細胞內(nèi)脂蛋白中的膽固醇通過溶酶體水解成為游離膽固醇，被釋放進入細胞質(zhì)，降解為膽汁酸前體。與膽固醇結(jié)合的溶酶體大量增加會引起溶酶體酶轉(zhuǎn)運通路的紊亂，從而使血液中的溶酶體酶水平升高。在高膽固醇環(huán)境下，細胞內(nèi)的CTSD水平升高并定位于細胞膜附近，極易被釋放入血。這就導致在肝臟脂肪變性的過程中，血清CTSD水平升高。有研究結(jié)果顯示，CTSD參與了炎癥反應及膽固醇轉(zhuǎn)運通路的調(diào)節(jié)[13]。WALENBERGH等[14]的研究結(jié)果顯示，血漿CTSD水平與兒童NAFLD密切相關。MOALLEM等[15]的研究結(jié)果顯示，CTSD與頸動脈內(nèi)膜中層厚度有關，可作為動脈粥樣硬化新的指標，CTSD水平還與溶酶體貯積癥的發(fā)病有關。本研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD組血清CTSD水平明顯高于正常對照組（P＜0.01），且與NAFLD嚴重程度呈正相關（rs=0.800 5，P＜0.000 1）。ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清CTSD診斷NAFLD的效能優(yōu)于ALT及GGT，且可用于鑒別診斷早期NAFLD，更適合于亞健康人群的篩查。

綜上所述，CTSD與NAFLD的進展密切相關，或可作為NAFLD早期診斷及分級的標志物，與ALT聯(lián)合檢測有助于NAFLD的早期診斷和干預。