李路路 侯士輝 張合紅 孫宗濤 檀根甲 陳劍平

(1安徽農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，安徽 合肥 230036；2寧波大學植物病毒學研究所，浙江 寧波 315211)

水稻黑條矮縮病是一種由水稻黑條矮縮病毒(rice black-streaked dwarf virus， RBSDV)引起的病毒性病害，在我國南方稻區(qū)廣泛流行[1-2]。 RBSDV 屬呼腸孤科(Reoviridae) 斐濟病毒屬(Fijivirus) 中的第二組成員[3]，主要經(jīng)灰飛虱以持久性方式傳播，但不會經(jīng)卵傳遞給子代幼蟲[4]。 RBSDV 寄主范圍廣泛，除了能侵染水稻、玉米外，還能在大麥、小麥、高粱、看麥娘、狗尾草等禾本科植物上引起病害[5]。 感染RBSDV 的水稻一般表現(xiàn)為植株矮小、葉色濃綠，莖稈基部表面有縱向瘤狀乳白色凸起，不抽穗或抽包頸穗，穗小顆粒少，直接影響水稻產(chǎn)量，嚴重影響我國糧食生產(chǎn)安全[6-7]。

在我國，水稻黑條矮縮病最早于1963 年在浙江省余姚縣的早稻上發(fā)現(xiàn)，同時在上海市嘉定和奉賢縣、江蘇省蘇州和鎮(zhèn)江等地區(qū)的水稻生產(chǎn)上有局部危害[8]。1991-2002 年浙江雜交稻區(qū)水稻黑條矮縮病又再次流行成災，發(fā)病面積達11.79 萬hm2，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失[9]。 目前對于RBSDV 的防控主要依賴于噴施化學農(nóng)藥，但由于灰飛虱的遷飛能力較強，防治效果并不理想，且長時間噴施化學農(nóng)藥對環(huán)境造成了一定程度的污染[10]。 因此，篩選抗性品種對于防治田間水稻黑條矮縮病至關重要。

植物激素茉莉酸(jasmonic acid，JA)和水楊酸(salicylic acid，SA)是調(diào)節(jié)植物免疫的重要內(nèi)源性信號分子，與植物的抗病性存在密切關系[11-13]。 現(xiàn)已明確JA 和SA 可通過激活植物體內(nèi)的防御基因表達，從而介導植物體對病原菌的抗性[14-15]。 其中，MYC2 是JA信號途徑抵御生物脅迫和非生物脅迫中的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，正調(diào)控植物的抗脅迫能力[16-17]；病程相關基因非表達子1(non-expresser of PR1，NPR1)是SA 途徑的重要抗性基因，NPR1 基因的大量表達可以誘導植物的系統(tǒng)獲得性抗性[18]。

本研究選擇20 個浙江省主栽水稻品種進行室內(nèi)人工飼養(yǎng)灰飛虱接毒，并栽種田間自然發(fā)病，篩選對RBSDV 抗性較強的水稻品種，以期為今后水稻黑條矮縮病的防治工作提供優(yōu)良抗性品種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試水稻品種:淮5、浙粳99、秀水14、秀水134、嘉禾218、寧88、紹糯9714、中嘉早17、中早39、浙優(yōu)18、Y 兩優(yōu)900、Y 兩優(yōu)17、Y 兩優(yōu)302、Y 兩優(yōu)957、深兩優(yōu)5814、甬優(yōu)15、甬優(yōu)9 號、甬優(yōu)538 和甬優(yōu)17，均購自浙江勿忘農(nóng)種業(yè)股份有限公司。

本研究使用的RBSDV 病苗采自山東省農(nóng)業(yè)科學院試驗田，無毒灰飛虱由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究院周益軍研究員提供。

1.2 RBSDV 人工接毒試驗

參照周彤等[19]、李碩等[20]的方法對灰飛虱進行飼毒。 首先將無毒的灰飛虱成蟲掃入播有二至三葉齡水稻苗的燒杯內(nèi)，產(chǎn)卵3～4 d 后掃出，6～8 d 后即可孵育出幼蟲。 將新孵育出的1 ～2 日齡的無毒灰飛虱幼蟲掃在RBSDV 病株上，飼喂3 ～4 d 后轉(zhuǎn)移到健康水稻苗上，渡循回期10 ～12 d。 當病毒在灰飛虱體內(nèi)循回到10 d 時，用ELISA-dot 方法檢測灰飛虱帶毒率。同時將待接毒的所有水稻品種播種于不同燒杯內(nèi)，每個品種播3 杯重復，每杯約播種35 粒。 所有燒杯均放置在25℃溫室內(nèi)生長7 d，按照5 頭/株的比例將帶毒灰飛虱轉(zhuǎn)移至不同品種水稻苗上，統(tǒng)一將所有秧苗經(jīng)帶毒灰飛虱咬食4 d，然后掃除全部灰飛虱并將所有品種水稻秧苗統(tǒng)一移栽大田，30 d 后取樣。

1.3 水稻發(fā)病癥狀觀察

RBSDV 侵染30 d 后，發(fā)病水稻的典型癥狀表現(xiàn)為植株矮小，葉色濃綠，分蘗增多，嚴重時還會引起植株枯死[21]，易于與健康水稻區(qū)分。 統(tǒng)計田間水稻株高并取樣，用液氮保存于-80℃。

1.4 植物總RNA 提取

采用Trizol 法。 首先將離心機預冷至4℃，稱取100 mg 新鮮水稻葉片，裝入盛有玻璃珠的2 mL RNAFree 離心管中，液氮速凍后放置于Tissuelyser-96 多樣品組織磨樣儀(上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司)中進行震蕩(30 Hz，60 s)。 樣品震碎后加入1 mL Trizol，混勻后4℃放置5 min，然后加入200 μL 氯仿(Trizol:氯仿＝1 ∶0.2，v/v)，上下翻轉(zhuǎn)15 s，混勻后4℃放置5 min，再于4℃條件下12 800 r·min-1離心20 min，保留上清液。 吸取上清液至新的1.5 mL RNA-Free 離心管中(用RNA-Free 的槍頭)，加入等量異丙醇，混勻后-40℃放置2 h，然后4℃條件下12 800 r·min-1離心20 min，棄上清液，沉淀用RNA-Free 75%酒精洗滌2 遍，最后經(jīng)LABCONCO 冷凍干燥機(無錫凱派克斯科技有限公司) 抽真空，烘干后加入適量焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate， DEPC)水溶解管中RNA。

1.5 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄

采用Vazyme 逆轉(zhuǎn)錄試劑。 20 μL 反應體系如下:移液器吸取1 μg 植物總RNA，加入4 μL 4×gDNA wiper Mix，用DEPC 水補齊至16 μL，輕輕吹打混勻后置于42℃金屬浴2 min，去除基因組DNA。 再加入4 μL 5×HiScript ⅡqRT Super Mix Ⅱ，輕輕吹打混勻后放入PCR 儀(Eppendorf，德國)進行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄程序:50℃，15 min；85℃，5 s。

1.6 RT-qPCR 試驗

采用上海翊圣生物科技有限公司的HieffTMqPCR SYBR? Green Master Mix (Low Rox Plus) 試劑。 10 μL 反應體系如下: 向0.5 μL 逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 中加入3.9 μL 滅菌水進行模板稀釋，每孔加該模板4.4 μL；另外分別吸取0.3 μL 引物F 和引物R 混入5 μL HieffTMqPCR SYBR? Green Master Mix 中，混勻后，每孔繼續(xù)加入5.6 μL 該混合液。 反應程序:95℃預變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共40 個循環(huán)。 PCR 結束后根據(jù)溶解曲線判斷引物特異性，采用2-ΔΔCt法分析基因相對表達量[22]。 共做3 次獨立試驗，每次3 個生物學重復，2 個技術重復。

2 結果與分析

2.1 水稻田間發(fā)病率統(tǒng)計

由表1 可知，粳稻品種在接種RBSDV 后的發(fā)病率相對較高，其中，淮5、浙粳99、秀水14、秀水134等品種的發(fā)病率均在40%～70%之間，而秈稻品種在接種RBSDV 后的發(fā)病率較低，處于20%～45%范圍內(nèi)。 粳稻品種受RBSDV 侵染后的植株尤為矮小，株高僅10 ～25 cm，發(fā)病癥狀嚴重，而秈稻品種感病后的株高仍能維持在20 ～50 cm，且發(fā)病癥狀輕，尤其是兩優(yōu)系列品種(深兩優(yōu)5814、Y 兩優(yōu)302 等)表現(xiàn)更明顯(圖1)。

2.2 不同水稻品種病毒含量差異分析

為了進一步檢測RBSDV 侵染后不同水稻品種體內(nèi)的病毒含量，本試驗選擇6 個不同發(fā)病程度的水稻品種(包括3 個粳稻品種和3 個秈稻品種)進行RTqPCR，分析不同水稻品種RBSDV 侵染后體內(nèi)的病毒RNA 水平。 由圖2 可知，與健康株比較，RBSOV 侵染后的所有水稻樣品體內(nèi)的病毒RNA 水平均出現(xiàn)顯著性上調(diào)。 為了便于分析，選用發(fā)病程度居中的甬優(yōu)17 作為參照，結果表明，粳稻品種淮5、秀水14 在RBSDV 侵染后病毒的S4、S6、S10 基因在RNA 水平上顯著上調(diào)，而秈稻品種深兩優(yōu)5814 和Y 兩優(yōu)302 中的病毒RNA 水平相對較低，這與大田水稻株高和發(fā)病率統(tǒng)計結果一致。

表1 不同水稻品種發(fā)病率統(tǒng)計表Table 1 Disease incidence of RBSDV inoculated rice plants

圖1 不同水稻品種的發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms in RBSDV-infected rice varieties

2.3 不同水稻品種JA、SA 信號途徑相關基因的差異表達分析

JA 和SA 在植物免疫過程中發(fā)揮重要作用，MYC2 和NPR1 分別是JA、SA 信號通路的關鍵基因，調(diào)控著植物的防御反應[23]。 本研究采用RT-qPCR 技術分析健康及RBSDV 感病水稻樣品中OsMYC2 和OsNPR1 基因的表達水平。 在淮5、秀水14、深兩優(yōu)5814 和Y 兩優(yōu)302 水稻中，感病植株OsMYC2 及OsNPR1 的mRNA 水平顯著高于健康植株(圖3)。 此外，秈稻品種深兩優(yōu)5814 和Y 兩優(yōu)302 中OsMYC2 和OsNPR1 在mRNA 水平的上調(diào)倍數(shù)也顯著高于粳稻品種淮5 和秀水14。

圖2 定量檢測RBSDV 基因侵染后不同品種水稻體內(nèi)病毒RNA 水平Fig.2 Expression level of genes of RBSDV RNA in RBSDV-infected rice varieties

3 討論

研究表明，對于水稻條紋葉枯病的侵染，粳稻一般抗病性較差，且在所有試驗水稻品種中未找到能夠?qū)λ緱l紋葉枯病表現(xiàn)出免疫的品種[24]。 在眾多水稻品種資源中，抗白葉枯的抗源多屬秈稻[25-26]。 張小明等[27]利用回交育種快速有效地將秈稻白葉枯抗性基因成功轉(zhuǎn)育到粳稻品種中，極大提高了粳稻抗白葉枯病的能力。 本研究分析了20 個水稻品種對RBSDV 的田間抗性，在接種RBSDV 30 d 后，秈稻深兩優(yōu)5814 和Y 兩優(yōu)302 的病苗株高、發(fā)病率及病毒RNA 水平都低于粳稻淮5 和浙粳99，說明秈稻品種可能比粳稻品種對RSBDV 的抵抗能力更強。 綜上所述，粳稻品種的抗病能力較弱，而秈稻品種的深兩優(yōu)5814 和Y 兩優(yōu)302 抗病能力更強，并不僅局限于對RBSDV 表現(xiàn)出抗性，這可能是一個普遍存在的現(xiàn)象。

植物在受到病原菌侵染時，體內(nèi)復雜的激素網(wǎng)絡可以迅速響應防御反應。 前期研究表明，在RBSDV侵染水稻過程中，JA 途徑相關基因的表達水平會顯著升高以響應JA 介導對RBSDV 的防御能力[28]。 同樣在煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)浸潤本氏煙(N. benthamiana)時，單獨噴施JA 或SA 都能夠有效抑制TMV 的侵染，JA 處理后再噴施SA 會對TMV的抑制效果更明顯[29]。 本研究通過RT-qPCR 分析發(fā)現(xiàn)，RBSDV 侵染后，所有水稻樣品中的OsMYC2 和OsNPR1 在mRNA 水平上全部上調(diào)表達，說明當RBSDV 侵染植物體時，體內(nèi)的JA、SA 抗病途徑被激活，防御反應開始應答。 而秈稻深兩優(yōu)5814、Y 兩優(yōu)302 的上調(diào)倍數(shù)顯著高于粳稻淮5、秀水14，在一定程度上更能說明秈稻深兩優(yōu)5814 和Y 兩優(yōu)302 可能比粳稻更能抵抗RBSDV 的侵染。

圖3 RBSDV 侵染后不同水稻品種OsMYC2、OsNPR1 基因的差異表達Fig.3 Expression level of OsMYC2 and OsNPR1 in different rice varieties after RBSDV infected

4 結論

本研究結果表明，RBSDV 侵染后秈稻的田間發(fā)病率和病毒含量比粳稻更低，發(fā)病癥狀更輕，尤其是兩優(yōu)系列品種如深兩優(yōu)5814 和Y 兩優(yōu)302 的表型最為明顯，在RBSDV 的侵染過程中表現(xiàn)出較強的抵抗能力，且多次室內(nèi)接種RBSDV 試驗結果均一致，表明在抗RBSDV 水稻品種篩選工作中，篩選出的秈稻深兩優(yōu)5814 和Y 兩優(yōu)302 水稻品種不僅能夠抵抗RBSDV 的侵染，而且具有穩(wěn)定的抗性。 此外，感病粳稻淮5 和浙粳99 體內(nèi)OsMYC2 和OsNPR1 的上調(diào)倍數(shù)遠低于秈稻深兩優(yōu)5814 和Y 兩優(yōu)302，說明各秈粳稻品種對RBSDV 所表現(xiàn)出的不同抗性與其體內(nèi)的JA 和SA 激素水平有關。 這為今后RBSDV 的防治工作提供了理論基礎，并為抗病育種篩選提供了新的思路。