劉青松　馬懿

摘 要：以花色苷、卵磷脂和膽固醇為原料，殼聚糖溶液加以修飾，用薄膜超聲法制備花色苷脂質體，待水化一段時間加入殼聚糖溶液，制備花色苷殼聚糖脂質體，高速離心機離心，測吸光度之差，算出脂質體的包封率，以包封率為質量指標。通過單因素實驗確定工藝中對脂質體包封率的影響因素，確定最佳方案，正交實驗確定脂質體的最佳生產工藝為：制備溫度40°C、卵磷脂加入量100mg、膽固醇加入量33mg、花色苷加入量1.25mg，在此條件下包封率達到40.2%。

實驗利用溫度、金屬離子來研究花色苷以及脂質體的穩(wěn)定性，采用DPPH法研究花色苷的抗氧化性，花色苷在低溫穩(wěn)定，高溫降解率極高，通過對比花色苷與脂質體在同樣溫度下的降解率，可以發(fā)現脂質體的降解率比花色苷低，也驗證了脂質體可以提高包封藥物穩(wěn)定性的特性，金屬離子實驗發(fā)現，花色苷及脂質體最好不要與銅、鐵物體接觸。而DPPH法測得的結果曲線也顯示出花色苷有著良好的抗氧化性。

關鍵詞：黑加侖花色苷;殼聚糖;脂質體;穩(wěn)定性;抗氧化性;包封率

ABSTRACT：To anthocyanins， lecithin and cholesterol as raw material， chitosan solution to decorate， anthocyanins liposomes with thin film prepared by ultrasound， stay hydrated for a period of time to join the chitosan solution， preparation of anthocyanins liposome chitosan， high-speed centrifuge， the difference between the measured absorbance， calculate the liposome envelopment rate， quality indicators for coating rate. The factors affecting the encapsulation rate of liposomes in the process were determined by single factor experiment， and the optimal scheme was determined. The optimal production process of liposomes was determined by orthogonal experiment： the preparation temperature was 40°C， the amount of lecithin added was 100mg， the amount of cholesterol added was 33mg， and the amount of anthocyanin added was 1.25mg. Under this condition， the encapsulation rate reached 40.2%.

Experimental temperature， metal ion is used to study the anthocyanins stability of liposomes， and DPPH method is used to study the oxidation resistance of anthocyanins， anthocyanins stability at low temperature， high temperature degradation rate is extremely high， by comparing the anthocyanins liposome and degradation rate under the same temperature， can be found that the degradation of liposome rate is lower than the anthocyanins， also verified the liposome can improve the properties of coating drug stability， metal ions， it was found that anthocyanins and liposome is best not to contact with copper， iron objects. The results obtained by DPPH method also showed that anthocyanins had good antioxidant properties.

Keywords： blackcurrant anthocyanins; Chitosan; Liposomes. Stability; Oxidation resistance; The encapsulation rate

1.材料與方法

1.1材料與儀器

卵磷脂、無水乙醇、膽固醇、殼聚糖、氯化鈣、氯化鈉、氯化亞鐵、氯化銅、磷酸二氫鈉磷酸氫二鈉、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼。

SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;RE-52系列旋轉蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;TGL-21臺式高速多功能冷凍離心機 上海百典儀器設備有限公司。

1.2試驗方法

1.2.1目標脂質體制備方法

稱取100mg大豆卵磷脂于燒杯中，再稱取25mg膽固醇于燒杯中，用10ml量筒稱取10ml無水乙醇加入燒杯中。在水浴型超聲儀中超聲3min，使膜材更好的溶解。將超聲好的膜材溶液裝進500ml旋蒸瓶中，在40°C的水浴溫度下，60r/min旋轉速度減壓蒸發(fā)除去無水乙醇，直到旋蒸瓶上形成一層磷脂膜，停止旋轉蒸發(fā)。將帶有磷脂膜的旋蒸瓶放入超聲儀中超聲1min幫助磷脂膜脫落，再加入10ml含有花色苷（黑加侖提取物）的磷酸緩沖液，繼續(xù)水浴超聲3min，轉移進錐形瓶中靜置1h，使其充分水化。取含有靜置1h以上的花色苷脂質體混懸液的錐形瓶，[1]將40ml的0.2%殼聚糖溶液[2]緩慢滴加到錐形瓶中，一邊滴加一邊震蕩混勻，待0.2%的殼聚糖溶液全部滴加完畢時，利用玻璃棒攪拌2min中以上，時間越長效果越好，錐形瓶中應該含有50ml液體，不足50ml時補加到50ml，將錐形瓶中的溶液轉移到50ml的尖底離心管中，做好順序標識，為了穩(wěn)定，在4°C的冰箱中保存一晚，方便第二天測定脂質體的包封率。

1.2.2測定方法

取制備的花色苷殼聚糖脂質體懸浮液加入到50ml離心管中，在10000r/min轉速下離心10min，取上清液后，再次在10000r/min離心5min取出上清液，與同樣方式離心得到的空白脂質體為參比，在紫外分光分度計上測定上清液的吸光度，代入花色苷標準曲線，得出未被包封的花色苷濃度[3]。

花色苷殼聚糖脂質體包封率計算公式：

包封率=（1-A/B）×100%? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?（1-1）

A為游離花色苷的量，B為總花色苷的量

利用DPPH法測定花色苷及脂質體的抗氧化性。DPPH溶液配制：實驗表明DPPH溶液濃度最好在20～70umol/L[4]，本文配制100umol/L DPPH溶液。具體過程如下：稱取9.85mg的DPPH溶解于乙醇，用250ml的容量瓶定容。

取2.0ml不同濃度的花色苷溶液與2.0mlDPPH溶液混勻，避光恒溫放置1h，用乙醇做參比，利用紫外分光光度計分別測定517nm時的吸光度A1;2.0ml花色苷溶液和2.0ml乙醇混合物的吸光度A2;2.0mlDPPH溶液和2.0ml乙醇混合物的吸光度A[5]3。

其中：A1：樣品溶液+DPPH溶液的吸光度值;A2：樣品溶液+無水乙醇的吸光度;A3：DPPH溶液+無水乙醇的吸光度。

1.2.3單因素試驗

確定膽固醇加入量為30mg，花色苷加入量為5mg，殼聚糖的質量分數為0.2%，卵磷脂加入量分別為：60mg、80mg、100mg、120mg、140mg，編號并進行5組試驗，每組3個平行實驗;選取卵磷脂加入量為120mg。確定卵磷脂加入量為120mg，花色苷加入量為5mg，殼聚糖的質量分數為0.2%，卵磷脂加入量：膽固醇加入量分別為：2、3、4、5、6，編號并進行5組試驗，每組3次平行實驗;考慮優(yōu)化實驗，選取卵磷脂加入量：膽固醇加入量為3。確定卵磷脂加入量為120mg，膽固醇加入量為40mg，殼聚糖的質量分數為0.2%，花色苷加入量分別為：2.5mg、5.0mg、7.5mg、10mg、12.5mg，編號并進行5組實驗，每組3次平行實驗;確定花色苷加入量為2.5mg。

1.2.4正交試驗與結果分析

2.結果與分析

2.1花色苷標準曲線

以黑加侖提取物的濃度對應吸光度繪制花色苷PBS溶液標準曲線如圖3-1所示。

黑加侖花色苷濃度與吸光度的回歸方程：y=0.2815x-0.007，相關系數R2=0.9997.表明花色苷濃度在0.125-4mg/ml范圍內呈良好的線性關系。

2.2單因素試驗結果

由圖可以看出隨著卵磷脂加入量的增加，脂質體的包封率先上升后下降，考慮優(yōu)化實驗，選取卵磷脂加入量為120mg。隨著卵磷脂：膽固醇的比例上升，脂質體的包封率先上升后下降，考慮優(yōu)化實驗，選取卵磷脂加入量：膽固醇加入量為3。隨著花色苷加入量的增加，脂質體的包封率一直下降，為進一步優(yōu)化實驗，確定花色苷加入量為2.5mg。

2.3正交試驗結果與分析

由以上數據經過一系列計算繪制方差分析表如下：

由上表可知：卵磷脂加入量在0.8-1.2g之間影響不顯著，卵磷脂加入量：膽固醇加入量比值在2、3、4之間也不顯著，而花色苷加入量對于脂質體的包封率有嚴重影響，經過正交實驗確定花色苷殼聚糖脂質體的最優(yōu)制作工藝為：卵磷脂加入量為100mg，膽固醇加入量為33mg，花色苷加入量為1.25mg。

2.4溫度對花色苷及脂質體的影響

由圖可知，低溫基本不影響花色苷的穩(wěn)定性，而高溫對花色苷穩(wěn)定性有極其嚴重的破壞性。溫度在常溫時：花色苷的穩(wěn)定性比較穩(wěn)定，花色苷的降解率一直在3%以下，隨著時間的增加，花色苷的穩(wěn)定性一直保持良好;

2.5金屬離子對花色苷及脂質體的影響

綜上實驗顏色改變及推斷：在制備和儲存時花色苷及花色苷殼聚糖脂質體時，一定要避免和含銅、鐵的物體接觸。

2.6花色苷的抗氧化試驗

由上圖可知：花色苷對于自由基的清除有著優(yōu)秀的能力，在花色苷濃度還比較低時，清除率不高，隨著花色苷的濃度的增加，花色苷的清除率呈直線上升，由此可以驗證花色苷有著優(yōu)秀的抗氧化性的能力。

3結論

經過正交實驗結果分析花色苷殼聚糖脂質體的最優(yōu)方案為100mg卵磷脂加入量、33mg膽固醇加入量、1.25mg花色苷加入量，在40°C的水浴中利用旋轉蒸發(fā)儀制備花色苷脂質體，待水化2H后加入殼聚糖溶液，制備成功花色苷殼聚糖脂質體?；ㄉ諝ぞ厶侵|體的包封率為40.2%。

經過溫度與金屬離子實驗發(fā)現：花色苷低溫條件穩(wěn)定，高溫條件極速降解。脂質體對花色苷包裹作用使花色苷在高溫條件下穩(wěn)定性提高，同樣溫度下的花色苷和被包裹的花色苷，未被包裹的花色苷的降解率是被包裹的花色苷的2倍，金屬離子實驗讓我明白花色苷或花色苷脂質體不能接觸銅、鐵容器。利用DPPH法測定花色苷的抗氧化性，確定花色苷具有很強的清除自由基的能力。并且隨著花色苷濃度增加而增強，在實驗設定的范圍內能達到88.2%的清除率。

參考文獻

[1] 鄧英杰.磷脂與脂質體技術.人民衛(wèi)生出版社，2007：166

[2] 嚴佳蕾，王小永.殼聚糖修飾脂質體對姜黃素的包載作用[J].中國測試，2016，42（9）：61-66

[3] 趙圣書.黑加侖花色苷脂質體制備及功能評價[D].黑龍江：東北林業(yè)大學，2013：13

[4] Sharma o p.Bhat t k.DPPH antioxidant assay revisited. [J]. Food CHemistry， 2009.113（4）;1202～1205.

[5] Sharma o p.Bhat t k.DPPH antioxidant assay revisited. [J]. Food CHemistry， 2009.113（4）;1202～1205.