康代利 王鑫

【摘要】鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus，DuCV）自從2003年被Hattermann發(fā)現(xiàn)以來，在我國(guó)各地區(qū)均有相關(guān)報(bào)道。鴨圓環(huán)病毒是一種無囊膜的單股環(huán)狀DNA病毒，病毒感染后會(huì)侵害機(jī)體的免疫器官，引發(fā)免疫抑制性疾病，使鴨的死亡數(shù)量增加。本研究主要通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室送檢的病料進(jìn)行DNA提取，進(jìn)行常規(guī)的PCR擴(kuò)增和凝膠電泳檢測(cè)，將檢測(cè)出的呈陽(yáng)性的病料送檢后進(jìn)行序列比對(duì)分析。經(jīng)過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)送檢樣品為DuCV基因II型陽(yáng)性病料，該結(jié)果為養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)鴨群感染情況提供了病原學(xué)流行情況的參考價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】鴨圓環(huán)病毒（DuCV）;PCR;DuCV-2型毒株

鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus， DuCV）是一種無囊膜單股環(huán)狀DNA病毒，結(jié)構(gòu)為二十面體對(duì)稱，屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）、圓環(huán)病毒屬（Circovirus），該病毒直徑大小為15-16nm[1]，當(dāng)鴨感染病毒后在鴨的心、肝、脾、肺、法氏囊、胸腺中均可發(fā)現(xiàn)DuCV，尤其在法氏囊、肺、胸腺中DuCV居多[2]，這也是鴨圓環(huán)病毒主要侵害的部位。鴨圓環(huán)病毒主要侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng)，造成機(jī)體的免疫功能和機(jī)體對(duì)疫苗的免疫應(yīng)答能力下降，使各類疫苗免疫效果減弱進(jìn)而導(dǎo)致免疫失敗，各種細(xì)菌和病毒容易侵入機(jī)體，引發(fā)鴨病的混合感染和繼發(fā)感染現(xiàn)象增多[1]。感染后鴨的臨床癥狀主要表現(xiàn)為羽毛凌亂、體重減輕、飼料轉(zhuǎn)化率降低、精神低沉等[3-5]。對(duì)病鴨進(jìn)行病理學(xué)檢查，其結(jié)果發(fā)現(xiàn)病鴨的背部羽毛出現(xiàn)囊泡，且囊泡周圍有炎性滲出，剖解可見脾臟、胸腺出現(xiàn)萎縮，并且散布一些大小不等、數(shù)量不一的白色病灶[3]。

在我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)，姜世金首先于2007年在福建省某鴨場(chǎng)的鴨群中檢測(cè)到鴨圓環(huán)病毒[6]。隨后，傅光華等于2008年在番鴨中檢測(cè)到鴨圓環(huán)病毒，并克隆出了該病毒的全基因序列[7]。李志國(guó)等通過對(duì)種鴨血清陽(yáng)性率較高的鴨場(chǎng)中孵化過程中死亡的胚胎以及剛出生不久的雛鴨進(jìn)行鴨圓環(huán)病毒檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在死亡的胚胎以及雛鴨中有鴨圓環(huán)病毒存在，這就表明鴨圓環(huán)病毒的傳播方式除了鴨群個(gè)體間的水平傳播以外，還有可能存在由親代傳遞給子代的垂直傳播[8]。

根據(jù)DuCV的Cap蛋白的基因序列，可將DuCV分為兩個(gè)基因型，即基因Ⅰ型和基因Ⅱ型[9-11]。同時(shí)，由于鴨圓環(huán)病毒發(fā)現(xiàn)較晚且缺乏適宜的體外培養(yǎng)方法，所以當(dāng)前對(duì)鴨圓環(huán)病毒的研究主要集中在核酸和蛋白的相關(guān)檢測(cè)追蹤。目前，對(duì)于鴨圓環(huán)病毒已經(jīng)報(bào)道的分子生物學(xué)檢測(cè)方法主要包括常規(guī)PCR檢測(cè)法、核酸探針檢測(cè)法[12]、套式PCR檢測(cè)法[13]、多重PCR檢測(cè)法、熒光定量PCR檢測(cè)法[5-9]以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[11]等方法。其中利用最廣泛、操作最簡(jiǎn)便的檢測(cè)法是常規(guī)PCR檢測(cè)法，常規(guī)PCR檢測(cè)法就是指在DNA聚合酶的催化作用下，對(duì)所需的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，其過程主要包括變性、退火、延伸，該過程在經(jīng)過多次循環(huán)重復(fù)后可得到擴(kuò)增的目的DNA片段。此次研究便是采用常規(guī)PCR檢測(cè)法對(duì)送檢病料進(jìn)行測(cè)序，從而得出檢測(cè)的樣本為鴨圓環(huán)病毒基因Ⅱ型。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料采集? 在山東臨沂某鴨場(chǎng)，對(duì)疑似感染鴨圓環(huán)的病鴨在死亡后無菌采集臟器病料（主要臟器包括法氏囊、胸腺、肺、心、肝、脾等），采集后送至實(shí)驗(yàn)室低溫保存。

1.1.2試劑? Simply P病毒DNA/RNA提取試劑盒（包括裂解液、去蛋白漂洗液、洗滌液、洗脫液、純化柱）、PCR反應(yīng)體系、PBS緩沖液、RO水、50xTAE、DL2000 DNA maker、Loading Buffer染液、GeneGreen核酸染料

1.1.3器材? 移液槍、槍頭、組織研磨器、BIO-RAD T100 型PCR儀、離心機(jī)、振蕩器、電子天平、恒溫水浴鍋、計(jì)時(shí)器、微波爐、電泳儀、電泳槽、制膠板、BIO-RAD Gel Doc XR型凝膠成像儀

1.2方法和步驟

1.2.1樣本前處理? （1）在-80℃冰箱中取鴨肝臟和肺臟組織，在無菌操作臺(tái)上用消過毒的剪刀剪下約黃豆大小的組織碎片（約0.1g），用鑷子將組織碎片分別放入兩個(gè)微型離心管內(nèi)，然后加入500uL PBS緩沖液，為使組織碎片充分研磨應(yīng)向試管內(nèi)加入一粒小鋼珠，在研磨結(jié)束后要將小鋼珠取出。（2）將離心管放入組織研磨儀的兩個(gè)研磨適配器中，離心管要盡量對(duì)稱放置同時(shí)要注意將研磨適配器固定牢固以免研磨適配器高速運(yùn)動(dòng)時(shí)打碎研磨儀玻璃。隨后給研磨儀通電開機(jī)設(shè)置儀器參數(shù)，設(shè)置其參數(shù)為：研磨設(shè)定頻率為50Hz、研磨運(yùn)行時(shí)間為60s、研磨中斷時(shí)間為10s、研磨運(yùn)行次數(shù)為8次。設(shè)置完畢后點(diǎn)擊控制面板上的Start鍵使研磨儀開始研磨。（3）待研磨完畢后，用鑷子取出管內(nèi)小鋼珠，放入燒杯內(nèi)用無水乙醇浸潤(rùn)清潔，防止鋼柱表面有碎片組織殘留。隨后將取出小鋼珠的兩個(gè)離心管置于離心機(jī)內(nèi)，設(shè)置離心機(jī)轉(zhuǎn)速為10000rpm，進(jìn)行離心操作1min，待離心操作完畢后再用移液槍吸取一定量的上清液，然后將上清液放入新的離心管內(nèi)進(jìn)行樣本提取。

1.2.2樣本提取操作 （1）用移液槍吸取200μL已處理好的樣本并將其加入到一個(gè)新的離心管中，隨后將移液槍更換槍頭后吸取500μL的裂解液加入其中，然后將離心管放在振蕩器上進(jìn)行振蕩，使混合液振蕩混勻，振蕩時(shí)長(zhǎng)約為30s。在振蕩過程完成之后再把離心管置于室溫中，放置10min。（2）將振蕩混勻后的混合液用移液槍轉(zhuǎn)移至純化柱內(nèi)，然后將離心時(shí)間設(shè)置為60s，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置為10000rpm，待離心結(jié)束后丟棄接液管中的廢棄液體。（3） 更換槍頭后用移液槍吸取500μL的蛋白漂洗液，將其加入純化柱中，離心時(shí)長(zhǎng)設(shè)置為30s，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速設(shè)置為12000rpm，待離心結(jié)束后丟棄接液管中的廢棄液體。（4）更換槍頭后用移液槍吸取500μL的洗滌液，將其加入純化柱中，離心時(shí)長(zhǎng)設(shè)置為30s，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速設(shè)置為12000rpm，待離心結(jié)束后丟棄接液管中的廢棄液體。（5）更換槍頭后再次用移液槍吸取500μL的洗滌液，將其加入純化柱中，離心時(shí)長(zhǎng)設(shè)置為30s，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速設(shè)置為12000rpm，待離心結(jié)束后丟棄接液管中的廢棄液體。（6）上一步完成后，再次將純化柱放置于離心機(jī)內(nèi)進(jìn)行離心操作，設(shè)置離心機(jī)的離心時(shí)長(zhǎng)為120s，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為12000rpm。（7）將接液管丟棄，然后準(zhǔn)備兩個(gè)新的1.5ml的離心管，把純化柱放置其中。再用移液槍吸取50μL洗脫液加入純化柱內(nèi)，然后把離心管置于恒定的室溫中，靜置時(shí)長(zhǎng)為120s。（8）再次進(jìn)行離心操作，本次離心時(shí)間設(shè)置為50s，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置為12000rpm，完成離心操作后將純化柱丟棄，此時(shí)組織中提取的DNA便存在于離心管內(nèi)。

1.2.3設(shè)計(jì)25μL PCR體系各試劑配比? （1）用移液槍吸取上下游引物各1μL加入到薄壁管內(nèi);（2）用移液槍吸取2×Taq PCR Mix 12.5μL加入到薄壁管內(nèi);（3）用移液槍吸取模板（核酸DNA）1μL加入到薄壁管內(nèi);（4）用移液槍吸取ddH2O 9.5μL，補(bǔ)齊至25μL。

1.2.4設(shè)置對(duì)照? （1）用移液槍吸取上下游引物各1μL加入到薄壁管內(nèi);（2）用移液槍吸取2×Taq PCR Mix 12.5μL加入到薄壁管內(nèi);（3）用移液槍吸取無菌水 1μL加入到薄壁管內(nèi);（4）用移液槍吸取ddH2O 9.5μL，補(bǔ)齊至25μL。注：為方便區(qū)分實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組應(yīng)在薄壁管的側(cè)壁及蓋子上用記號(hào)筆寫上編號(hào)。

1.2.5擴(kuò)增? 打開PCR擴(kuò)增儀（BIO-RAD T100 型），按照默認(rèn)的預(yù)定程序進(jìn)行設(shè)置操作，將上述含有模板DNA的反應(yīng)體系和對(duì)照組放入PCR儀內(nèi)。具體程序如下：（1） 95℃ 3min進(jìn)行預(yù)變性;（2）95℃ 30s進(jìn)行變性;（3）55℃ 30s進(jìn)行退火;（4）72℃ 1min進(jìn)行延伸;（5）循環(huán)（2）（3）（4）步驟35次;（6）再次進(jìn)行72℃延伸，5min。待以上步驟完成后，點(diǎn)擊控制面板上的Cancel鍵，然后打開PCR擴(kuò)增儀，取出樣品，取出后記得關(guān)閉PCR儀，在進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)前要先將樣品保存在4℃的冰箱中。

1.2.6凝膠板制備? （1）取20ml 50xTAE溶液，按1：49的比例配制1000ml 1xTAE溶液（即20ml 50xTAE溶液，980ml無菌水），配制好的溶液要充分振蕩混勻。（2）使用稱量天平稱取0.7g瓊脂糖粉末，放至于一個(gè)錐形瓶中，再將制備的700ml 1xTAE溶液加入錐形瓶，然后將錐形瓶小心的放于微波爐里，用中火或高火進(jìn)行加熱，直到瓶?jī)?nèi)的液體沸騰為止，沸騰后拿出搖勻，使瓊脂糖均勻分散，然后繼續(xù)重復(fù)加熱至沸騰，直至溶液完全變的澄清透明，然后再用移液槍向錐形瓶加入7μL的GeneGreen核酸染料。（3）將有機(jī)玻璃制膠板槽水平放置，然后在一側(cè)插好梳子，再將之前制備好的混合液倒入制膠板槽中，倒入時(shí)應(yīng)小心均勻倒入，以免產(chǎn)生氣泡，隨后在室溫中冷卻50min左右，觀察凝膠是否完全凝固，當(dāng)凝膠完全凝固之后，為避免凝膠損壞應(yīng)該小心的將梳子向上垂直拔出。

1.2.7加樣? 用移液槍吸取適量的Loading Buffer染液均勻的滴在鋪平的塑料手套上，使之分成若干份。再用微量移液槍吸取DL2000 DNA maker10μL 、樣本A、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各5μL與Loading Buffer染液均勻混合后加入瓊脂中。

1.2.8電泳? （1）上述加樣步驟完成后將加樣孔置于陰極端放于電泳槽中，凝膠板要放置平整，不可歪斜，將配制好的1xTAE溶液加入到電泳槽中并使其水平液面超過凝膠表面。然后打開電源將電泳儀通電跑膠。（2）當(dāng)電泳進(jìn)行至40min左右時(shí)，可明顯觀察到染液有一定距離的移動(dòng)。待電泳結(jié)束后，小心取出凝膠，將之放入凝膠成像系統(tǒng)中，打開機(jī)器紫外線按鈕，并打開電腦軟件進(jìn)行操作，就可得到電泳圖，然后將跑好的電泳圖拍照或截圖保存以作結(jié)果分析。

2結(jié)果與分析

2.1PCR檢測(cè)結(jié)果? 將PCR擴(kuò)增后得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后可在凝膠成像系統(tǒng)中得到鴨圓環(huán)病毒Ⅱ型基因型的條帶。如圖2-1，從結(jié)果中分析可得，DuCV-2引物擴(kuò)增出950bp左右的條帶，與陽(yáng)性對(duì)照基本一致。

2.2鴨圓環(huán)病毒部分基因片段同源性分析? 將測(cè)序毒株LW4與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中鴨圓環(huán)病毒部分基因進(jìn)行同源性序列分析， 經(jīng)過DNA Star軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)，分離株LW4與鴨圓環(huán)病毒Ⅱ型與參考株（AY394721.seq）的同源性最高，可達(dá)100%，其次是與DQ166837株同源性達(dá)到99.8%，與其他參考株的同源性在82.7～99.8%之間（圖2-2），由此可確診為鴨圓環(huán)病毒Ⅱ型。

2.3鴨圓環(huán)病毒部分基因片段系統(tǒng)基因進(jìn)化樹 利用DNA Star軟件對(duì)20株毒株進(jìn)行分析比較，可繪制出基因進(jìn)化樹（圖2-3），從圖中可得知DuCV-2與AY394721.seq位于基因進(jìn)化樹的同一分支上，所以這兩個(gè)毒株的親緣關(guān)系極近，判定為鴨圓環(huán)病毒Ⅱ型。

M為2000marker; 1為肝臟組織擴(kuò)增條帶; 2為腎臟組織擴(kuò)增條帶; 3為肺臟組織擴(kuò)增條帶; 4為陽(yáng)性對(duì)照; 5為陰性對(duì)照。

3討論

鴨圓環(huán)類病毒主要是侵害機(jī)體的免疫器官，引發(fā)免疫抑制性疾病，同時(shí)鴨圓環(huán)病毒可能會(huì)提高鴨疫里默氏桿菌、鴨瘟病毒等常發(fā)病的發(fā)病率[3][5]，并加重發(fā)病的臨床癥狀，使鴨的發(fā)病率也不斷增多，同時(shí)這表明鴨圓環(huán)病毒在繼發(fā)感染、交叉感染中起著重要作用。在感染鴨圓環(huán)病毒的鴨群中存在著羽毛發(fā)育不良、體重減輕、精神低沉等臨床癥狀，病理學(xué)檢查可見淋巴細(xì)胞損傷、減少，剖解可見法氏囊、胸腺萎縮，這些都表明鴨圓環(huán)病毒可引發(fā)免疫抑制[1]。目前，在我國(guó)各個(gè)省份的鴨場(chǎng)中均發(fā)現(xiàn)有DuCV感染病例的存在，山東又是肉鴨養(yǎng)殖較為集中的地區(qū)，為此王鑫[10]等通過利用間接ELISA檢測(cè)法對(duì)濰坊和泰安數(shù)十個(gè)鴨場(chǎng)的數(shù)千份血清進(jìn)行了鴨圓環(huán)病毒抗體檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濰坊鴨場(chǎng)的陽(yáng)性率明顯高于泰安，這主要是由于濰坊的鴨場(chǎng)建設(shè)早于泰安，這就表明了在一些老舊的鴨場(chǎng)中DuCV的污染率更高。另外，李志國(guó)等[9]通過對(duì)種鴨血清陽(yáng)性率較高的鴨場(chǎng)中孵化過程中死亡的胚胎以及剛出生不久的雛鴨進(jìn)行DuCV檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在死亡的胚胎以及雛鴨中有DuCV存在，這就表明鴨圓環(huán)病毒的傳播方式不僅有水平傳播而且還有可能存在垂直傳播。總之，雖然目前對(duì)鴨圓環(huán)病毒有一定程度的了解但是由于鴨圓環(huán)病毒不能分離培養(yǎng)，所以對(duì)鴨圓環(huán)病毒的診斷和防治帶來一定的困難。利用簡(jiǎn)單易操作靈敏度高的常規(guī)PCR對(duì)鴨圓環(huán)進(jìn)行檢測(cè)，這是目前比較行之有效的方法。本研究選用根據(jù)鴨圓環(huán)病毒Ⅱ型保守序列所設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)鴨圓環(huán)病毒Ⅱ型的靶基因進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行凝膠電泳，將電泳好的凝膠放在凝膠成像儀下觀察，得出結(jié)果圖并進(jìn)行分析，最終在病料中檢測(cè)出的病毒基因型鑒定為鴨圓環(huán)病毒Ⅱ型，這為鴨場(chǎng)此次發(fā)病的病因排查提出了有力的證據(jù)。

4結(jié)論

經(jīng)過對(duì)病料進(jìn)行電泳圖譜分析可確定病料為陽(yáng)性，基因型為Ⅱ型基因型。在鑒定鴨圓環(huán)病毒及基因分型方面，常規(guī)PCR方法具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，對(duì)以后鴨圓環(huán)病毒的研究提供了重要技術(shù)支持。

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通訊作者：王鑫，女，1985.7，動(dòng)物病毒學(xué)研究，coala07@163.com